[发明专利]一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法

说明书

本发明公开了一种蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法，其以天然蜂毒干粉或者采用生物多肽固相合成法合成的蜂毒溶血肽粗肽为原料，经过凝胶过滤色谱柱分离、反相高效液相色谱纯化，制得质量含量大于98%蜂毒溶血肽，其中在凝胶过滤色谱柱分离过程中采用隐蔽剂溶解；然后将蜂毒溶血肽经过超滤膜、纳滤膜、半透膜中的一种或几种分子筛处理后，即得到无溶血活性的蜂毒肽；通过本发明方法处理后即可“隐蔽”蜂毒溶血肽的溶血毒副作用；如果以小于1mmol/L有机酸及其盐缓冲液处理，其又具有溶血活性，这一点用纯水（注射用水）处理后即可证实。

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种高纯度、高活性蜂毒肽的制法，具体为蜂毒溶血肽隐蔽溶血毒副作用的方法。

背景技术

众所周知，蜂毒是工蜂用其螫针刺向敌害时从螫针内排出的毒汁，故称蜂毒。我国传统中医利用蜂毒疗法治疗疾病已有悠久的历史，特别是对于治疗风湿、类风湿性关节炎、肩周炎等疾病都有较好的疗效。近年来，随着分离、纯化和生物合成技术的不断提高，在研究蜂毒组成成分、结构的基础之上，探讨了其功能及作用机理，为进一步临床应用奠定了基础，并展示了较好的应用前景。

蜂毒溶血肽（ Melittin）（或蜂毒肽或蜂毒素）是具有抗耐药病菌抗生素的重要候选分子之一，具有很强的广谱抗菌消炎活性，但因其有溶血的毒副作用和从天然获得较困难而限制了它的应用。因此，我们在保留抗菌活性基础上，消除其溶血活性。蜂毒溶血肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒溶血肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用，还有很强的溶血活性，限制了其临床应用。

蜂毒干粉中含有肽类、酶类及非肽类的主要活性成分。肽类主要包括蜂毒溶血肽、蜂毒明肽及肥大细胞脱颗粒多肽。酶类主要是磷脂酶A2受蜂螫之后产生过敏反应的主要物质。非肽类物质包括组胺、各种生物胺类物质，其与受蜂螫之后产生疼痛有关。

蜂毒溶血肽是蜂毒的主要组成成分及活性成分，约占蜂毒干重的50%左右；具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学作用。蜂毒溶血肽为白色或类白色粉末，分子量为2840 D，由26个氨基酸残基组成，其一级结构的氨基酸残基序列为：

NH₂-GLY-ILE-GLY-ALA-VAL-LEU-LYS-VAL-LEU-THR-THR-GLY-LEU-PRO-ALA-LEU-ILE-SER-TRP-ILE-LYS-ARG-LYS-ARG-GLN-GLN-COOH

自从1967年Habermanm等人首先从蜂毒中分离出由26个氨基酸组成的蜂毒溶血肽以来，分析了其氨基酸序列，证明其结构中无二硫键。1980年Anderson等观察了三级结构，结果表明蜂毒肽的空间结构可分为四个区域：即(1～10)N末端α螺旋结构，(11～13)C以120°角连接两个螺旋的绞链结构，(13～20)C α螺旋结构，(2l～26)C末端是正电荷区域。这样的四个单体通过疏水基相连，形成了四聚体的稳定结构，5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的C端（KRKR），是典型的阳离子抗菌肽。蜂毒溶血肽能够形成两亲性的α-螺旋结构，具有广谱抗菌，抗病毒功能和较强的溶血活性等特点。但当蜂毒溶血肽与细胞膜结合发挥作用时，却是以单体的形式排列在细胞膜表面，但仍具有明显的细胞毒作用（溶血活性）。蜂毒肽是广谱抗菌肽，其抗菌、抗病毒的作用是蜂毒肽通过与膜结合的方式破坏细菌胞膜达到杀菌的目的。