[发明专利]用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法

说明书

一种用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法，该方法通过从菌株Chlorella viruss的基因组中使用甲基转移酶M.CviRI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.CviRI的基因，再实现限制性内切酶ApaLI的重组表达菌株的构建，最后重组表达质粒pBAD‑R.ApaLI转化感受态细胞[pACYC184‑M.CviRI，ER2566]进行筛选培养，获得限制酶ApaLI的重组表达菌株。本发明实现了限制性内切酶ApaLI的高效重组表达；利用阿拉伯糖操纵子表达系统严苛控制限制性内切酶ApaLI的本底表达水平；筛选出的M.CviRI甲基化保护菌株同样可应用于其他具有类似识别位点的限制酶的重组表达。

技术领域

本发明涉及一种菌株的筛选方法，特别是一种用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法。

背景技术

在生物体内有一类能将外来的DNA切断的酶，它能够限制异源 DNA的侵入并使之失去活力，但对自身的DNA却无损害作用，这样就可以起到保护细胞原有的遗传信息的作用。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。其发现促使DNA重组技术的诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具。

由于细菌体内存在“限制-修饰”现象，即自身的DNA被甲基化酶修饰，从而避免所产生的限制酶对自身DNA片段的切割，达到抵御外来噬菌体侵染的目的。因此在原核表达体系中单一的重组表达限制酶，会使宿主因DNA被切割而死亡。而甲基转移酶在识别序列上的特异性修饰可防止限制性内切酶的切割。限制-修饰基因常紧密连锁，细菌通过调控两者的表达，使自身DNA首先受到甲基化保护, 保护完成后再表达限制酶，而入侵的异源DNA并没有受到保护因而被限制性内切酶降解。即胞内相关的甲基转移酶对与其配对限制性内切酶识别的相同特定序列进行甲基化修饰，并使修饰的DNA具有抵抗其限制性内切酶的切割的特性，保护宿主DNA而降解未被甲基化的外源DNA(Geoffery G.W.,Nucleic Acids Res,2539-2564.1991)。

关于限制-修饰系统在原核细胞中表达的研究表明,系统的建立和维持是以甲基转移酶的保护作用为前提。甲基化修饰是蛋白质翻译后修饰的重要形式之一，参与了原核生物和真核生物的多种细胞进程。基于DNA分子的结构组成和特性，自然界中主要存在三类DNA甲基转移酶，分别是C⁵胞嘧啶甲基酶、N⁴胞嘧啶甲基酶和N⁶腺嘌呤甲基酶。其中，N⁴胞嘧啶和N⁶腺嘌呤甲基酶属于氨基-甲基转移酶 (Malone et al.J.Mol.Biol.253:618-632.1995)。DNA在甲基转移酶作用下，催化底物S-腺苷甲硫氨酸，转移一个甲基至胞嘧啶的C5位置，生成5-甲基胞嘧啶的过程。当一个有限制酶识别位点的DNA被甲基转移酶修饰后，这个DNA分子就会具有抵抗相应限制酶的酶切的特性。即通常情况下，如果DNA识别序列相同(或识别序列包含在内) 并且甲基化酶修饰位点和方式也一致，那么这种经过甲基转移酶特异性甲基化修饰的DNA就具有可以抵抗相似识别序列的限制性内切酶切割的作用，从而保护宿主细胞的DNA免受破坏。例如AluI的识别序列是5’AGCT3’,包含在SacI的识别序列之中(5’GAGCTC3’)，而且其甲基化位点和修饰方式一致(C⁵胞嘧啶甲基酶)，因而可以通过在宿主菌内表达M.AluI来抵抗限制酶SacI对DNA的酶切。