[发明专利]用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)甲基转移酶M.CviRI的重组表达菌株的建立

a、甲基转移酶M.CviRI基因的获取

甲基转移酶M.CviRI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库方法，从菌株Chlorella viruss的基因组中使用甲基转移酶M.CviRI基因的特异性引物获得了甲基转移酶M.CviRI的基因；

b、构建甲基转移酶M.CviRI的重组表达菌株

将M.CviRI基因序列以酶切-连接的方式插入低拷贝表达载体pACYC184质粒中，连接产物转化进入克隆菌株DH5α并涂布于氯霉素抗性平板进行培养；

c、甲基化保护菌株的筛选

对转化后菌株进行甲基化保护程度的筛选；

d、限制性内切酶ApaLI基因的获取

限制酶ApaLI基因的获得采用PCR扩增、基因合成或者提取染色体DNA并建立文库的方法，从菌株Acetobacter pasteurianusmogenes的基因组中使用限制酶ApaLI基因的特异性引物获得限制酶ApaLI的基因；

e、限制性内切酶ApaLI的重组表达菌株的构建

使用阿拉伯糖操纵子表达系统，将ApaLI基因序列以酶切-连接的方式插入到pBAD的表达质粒中，连接产物转化进入DH5α克隆菌株并涂布于氨苄青霉素抗性平板进行培养；通过测序确认重组质粒构建成功后，将其转入R.ApaLI特异性保护菌株[pACYC184-M.CviRI，ER2566]，构建限制酶ApaLI的重组表达菌株；

(2)限制性内切酶ApaLI的重组表达

将测序正确的重组表达质粒pBAD-R.ApaLI转化感受态细胞[pACYC184-M.CviRI，ER2566]，涂布于含氨苄青霉素和氯霉素抗生素的平板上筛选培养，获得限制酶ApaLI的重组表达菌株；该菌株经扩大培养后，以阿拉伯糖诱导，获得限制酶ApaLI的重组蛋白，并确认细菌蛋白粗提液具有限制酶ApaLI的活性。

2.根据权利要求1所述的一种用于表达限制性内切酶ApaLI的甲基化保护菌株的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，从菌株Chlorella viruss的基因组中使用甲基转移酶M.CviRI基因的特异性引物PCR扩增获得了甲基转移酶M.CviRI的基因；获得甲基转移酶M.CviRI基因的方法如下：

菌株Chlorella viruss平板培养菌落以去离子水重悬后，95℃温育10min，作为PCR模板；PCR扩增的引物序列基于甲基转移酶M.CviRI基因的上游引物5’-端序列及下游引物3’-端反向互补序列进行设计合成；

合成的引物序列如下所示:

正向引物：

反向引物：

这一对引物用于特异性扩增M.CviRI基因，同时引入NdeI与XhoI的酶切位点，方便后续酶切-连接以及筛选实验；PCR扩增反应使用MonHI-FI DNA Polymerase，按照标准PCR反应流程进行，获得了与理论值大小一致的M.CviRI基因片段序列1；上述PCR扩增产物通过酶切-连接的方式与pACYC184载体形成重组表达质粒。