[发明专利]用于筛选乙肝治疗剂的组合物和筛选方法

说明书

本发明提供了一种用于筛选乙肝治疗剂的组合物，其包括至少一种载体，所述至少一种载体包括：(a)单细胞治疗有效量的至少一种待筛选乙肝治疗剂；(b)独特地识别所述至少一种乙肝治疗剂的一个或多个核酸条码；和(c)任选的标记。本发明还提供了使用所述组合物的筛选方法。

技术领域

本发明涉及抗病毒药物筛选技术领域，具体地，涉及一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法，及相应的筛选用组合物。

背景技术

人乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的重要公共健康问题。急性乙肝病毒感染后，仍有8％左右发展为慢性乙肝感染，持续性HBV感染将导致肝硬化，甚至肝癌。我国是乙肝大国，乙肝病毒携带者接近1.3亿人，约占总人口的9％。尽管随着乙肝疫苗的大范围普及，新乙肝感染率得到有效控制，但乙肝携带人口基数大，防治乙肝成为我国公共健康问题的重中之重。乙肝传播途径主要通过垂直传播与水平传播。垂直传播是指母婴传播；水平传播主要通过血液传播。

尽管目前市场上有很多抗HBV药物，主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。其中核苷类似物通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生。逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物严重的副作用等问题也不容小觑。针对HBV本身进行从头抗病毒药物研究成为一种迫切需求。想要获得从头抗病毒药物，必须先建立一种合适的药物筛选方法。

现有的乙肝药物筛选方法包括细胞水平筛选方法和动物水平筛选方法等。

细胞水平筛选方法能够直观地以模型细胞为对象筛选治疗剂的抗乙肝病毒功效，应用最为广泛的HBV细胞模型是1986年Sells等用重组载体pDoLT-HBV-1(含2个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)转染HepG2细胞，经G418筛选获得的高水平分泌HBeAg及HBsAg的HepG22.2.15细胞模型，HBV病毒在HepG22.2.15细胞内复制可持续很长时间，可传代培养维持达1年。该模型下的评价指标包括细胞内的HBV病毒DNA(如cccDNA、rcDNA、dsNDA)和RNA(如mRNA、pgRNA)水平以及细胞培养液中的乙肝抗原(如HBeAg、HBsAg等)水平等，然而，细胞水平实验无法全面地体现待筛选药物的实际抗病毒功效，因为其忽视了药物在治疗患者体内的实际代谢过程、肝脏靶向性以及PK/PD等因素。在细胞水平筛选获得的优异治疗剂并不一定能够在患病对象体内同样有效。

动物水平筛选方法包括构建适当的动物模型，并通过体内筛选方法筛选抗乙肝病毒药物。人类HBV属于嗜肝DNA病毒科，有较强的种属特异性，HBV自然条件下只感染人、非人灵长类(如黑猩猩等)及树鼩。近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研究人员亦建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型，基因转染HBV小鼠模型及HBV转基因小鼠模型等，参见CN104862336A、CN107080757A等(其公开内容通过引用全部并入本文)。相比于细胞水平筛选方法，动物水平筛选方法能够更全面地体现乙肝药物在患者体内的实际功效，为临床乙肝药物筛选提供有力的依据。然而，当前的动物水平筛选方法依旧存在着诸多问题，例如难以实现高通量、多药物同时筛选，筛选效率较低；药物体内递送后缺乏肝靶向性(包括肝部靶向性和肝细胞靶向性)，治疗效率低下，且缺乏高灵敏度的检测标记，由此导致检测难度较大，药物筛选分辨率低。

脂质体(liposome)是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25-1000nm不等。脂质体可用于转基因技术，或用于制备药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。此外，利用肝、脾网状内皮系统的被动靶向性，脂质体可靶向肝部，如肝利什曼原虫药锑酸葡胺脂质体，其肝中浓度比普通制剂提高了200～700倍。将脂质体作为载体封装抗乙肝药物可潜在改善其肝靶向性，并利用其脂质双层与亲脂性细胞膜的相似性，协助将亲水性药物以及带电荷的DNA等载入肝细胞内。然而，将脂质体技术直接用于抗乙肝药物的高通量体内筛选尚无文献报道。