[发明专利]一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法

说明书

本发明涉及一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，首先重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His‑tag抗体捕获，对于色度信号，可直接再自然光源下用相机拍照，对于荧光信号，将试纸条放置于多功能成像仪中拍照，随后对图像进行分析及结果判定。本发明提供的方法利用噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白为荧光供体，以抗氯噻啉抗体偶联的胶体金颗粒为荧光受体，根据荧光内滤效应，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的检测。本发明灵敏度高、快速、简便、经济、实用性强，可以对小分子的定量、在线检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析方法，利用噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白为荧光供体，利用分析物抗体偶联的胶体金做为荧光受体，根据荧光内滤效应，以侧流层析的方式实现对小分子化合物的在线、定量及高敏感性检测。

背景技术

氯噻啉是我国自主研发的新烟碱类杀虫剂，广泛用于防治小麦、水稻、果树和蔬菜等作物上的害虫。然而，过量的使用使其广泛分布于水体和农产品中，对非靶标生物如蜜蜂等造成了潜在的威胁。因此，建立简单、快速、灵敏的检测方法监测环境和农产品中氯噻啉残留是保障环境和农产品安全的重要抓手。

噬菌体展示随机多肽库已广泛应用于免疫检测，病原细菌检测，细胞成像等领域。在小分子免疫分析中，噬菌体展示随机肽的主要有两个用途：1)筛选模拟表位代替化学半抗原或分析物，开发竞争型免疫分析；2)筛选抗免疫复合体，其能与抗原-抗体的复合物结合，开发非竞争型免疫分析。噬菌体展示随机多肽容易获得且在分析中具有较高的敏感性。然而，由于噬菌体颗粒的尺寸较大(880×6-7nm)，流动性较差，限制了噬菌体展示肽的应用。使得噬菌粒展示多肽技术不适合用于开发快速检测。另一方面，噬菌体不是一种常规的生产试剂，作为商业试剂使用可能存在不同批次间的差异，长期储存的稳定性和其生物安全性也进一步限制了其应用。为了克服这些缺陷，通过化学方式合成噬菌体展示的多肽，并与载体蛋白，纳米颗粒或者链霉亲和素偶联，已经被用于开发无噬菌体的小分子免疫分析，但化学合成代价较高，合成后仍需标记。并不适合大量生产。将多肽与蛋白质融合表达制备重组蛋白，则可通过细菌发酵来实现大量的生产，大大降低成本。而且，如果与多肽融合的蛋白是荧光蛋白，那么这种重组蛋白则又可以直接作为示踪物，避免了标记步骤。

荧光内滤效应是当荧光供体的发射光谱与荧光受体的吸收光谱重叠时，受体对供体发射荧光重吸收，导致荧光强度减弱的现象。目前，基于荧光内滤效应的免疫分析方法已被应用小分子，蛋白质，核酸等的检测。增强型绿色荧光蛋白为绿色荧光蛋白的突变体，在光稳定性和光强度方面的性能被大大提高，且容易在大肠杆菌中表达，是一种理想的蛋白类荧光供体。胶体金是通过弱还原剂还原氯金酸中的金离子，制备的一种纳米颗粒，已被广泛应用于免疫层析试纸条。胶体金合成简单，成本较低，性质稳定，吸收光谱宽，且易于和各种生物大分子偶联，是一种理想的荧光受体。

以噬菌体展示多肽模拟表位与增强型绿色荧光蛋白的重组蛋白(在C端带有一个His标签)为荧光供体，利用分析物抗体偶联的胶体金颗粒做为荧光受体，开发一种双信号(色度信号和荧光信号)侧流免疫层析方法。色度信号由胶体金产生，荧光信号由重组蛋白产生。当分析物浓度增高时，与重组蛋白结合的胶体金减少，使得检测线处的色度信号降低，色度信号与分析物浓度呈负相关；同时，由于荧光内滤效应，重组蛋白的荧光强度得以恢复，荧光信号与分析物浓度呈正相关。

该发明为食品安全检测、农产品等的出入境检测、环境监测部门的监测提供有效的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续发展和食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。目前，国内外尚未见有基于模拟表位多肽与荧光蛋白重组表达示踪物的双信号侧流免疫层析方法的报道。

发明内容