[发明专利]一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法

权利要求书

1.一种氯噻啉的双信号侧流免疫层析检测方法，其特征包括：

第一步：重组示踪物与分析物共同竞争偶联在胶体金上的分析物抗体的结合位点，随后重组示踪物被抗His-tag抗体捕获，

硝酸纤维素膜的处理：用PBS稀释的抗His-tag抗体4.0mg/mL和羊抗鼠IgG抗体1.0mg/mL分别作为检测线和控制线，以1μL/cm的速度喷在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜在37℃下干燥1小时，将分析物抗体标记的胶体金溶液以34μL/cm的速度喷在已用含1mg/mL BSA的PBS溶液处理的结合垫上，然后将处理好的硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫组装成整条，切成3.5mm宽，在室温下储存备用；加样：将75μL的样品与75μL的重组示踪物：SEQID No.1所示序列含有4μg蛋白质，0.5％吐温20混合，将混合物滴到样品垫上，并流过膜15分钟；

第二步：硝酸纤维素膜上的双信号的检测，

色度信号：将试纸条置于自然光源下，用相机直接拍照获得图像，

荧光信号：将试纸条置于多功能成像仪中，设置激发波长为470nm，滤光片为535nm，用成像仪自带相机拍照获得图像；

第三步：检测结果的分析及结果判定，

方法1：将第二步中获得的两种图像均导入imageJ 1.46r软件中，测量检测线区域和相邻检测线区域的平均灰度/光密度值，以相邻检测线区域的平均灰度/光密度值为背景信号，用检测线区域的平均灰度/光密度值减去所述背景信号，得到校正后的检测线区域平均灰度/光密度值，以校正后的检测线区域平均灰度/光密度值为纵坐标，氯噻啉标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将样品的校正后的检测线区域平均灰度/光密度值带入线性方程中计算出样品中氯噻啉的含量；

方法2：用肉眼直接观察从第二步中获得的在自然光源和多功能成像仪中拍摄的图像，相对阴性对照的结果：在自然光源下拍摄的图像，若检测线区域有颜色条带为阴性，若检测线区域无颜色条带则为阳性；在多功能成像仪中拍摄的图像，若检测线区域未出现绿色荧光为阴性，若检测线区域出现明显绿色荧光为阳性。