[发明专利]一种测序方法

说明书

本发明实施例涉及基因测序领域，公开了一种测序方法，包括:提供测序芯片以及位于测序芯片上的开口限定层，开口限定层内具有至少一个开口，开口下方设置有检测模块，且开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；在待测核酸分子上修饰与核酸接头碱基互补配对的核酸序列；向开口内加入扩增反应液及待测核酸分子，待测核酸分子在开口内的核酸接头处进行核酸扩增反应流程；在核酸扩增反应流程之后，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列。本发明中，测序方法不再依赖微球载体，降低了测序成本；同时过程中不涉及使用微球，提高了测序通量。

技术领域

本发明实施例涉及基因测序领域，特别涉及一种测序方法。

背景技术

基因测序技术作为最重要的分子生物学分析方法之一，不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。基因测序技术的发展经历了几个重要阶段：经典的手工测序，主要依赖于一些生物化学方法和电泳分离技术,包括Sanger测序和DNA化学降解测序；第一代测序技术，主要基于Sanger法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化；第二代测序技术，主要包括Solexa测序、Solid平台、454测序，及第2.5代测序技术中Ion Torrent，被称为新一代测序，它们的测序原理不完全相同，但均实现了更高的通量。

然而，本发明的发明人发现现有技术中至少存在如下问题：

目前，454焦磷酸测序平台和Ion Torrent测序平台所涉及的测序方法依赖微球载体，需要将接头、引物及DNA片段附着在微球上，但微球的尺寸限制了半导体芯片的阵列的密度及规模，从而在一定程度上限制了测序的通量，并且微球的制作、文库制备、微球加载至阵列中的步骤繁琐，成本昂贵，影响了测序的单次成本。

发明内容

本发明实施方式的目的在于提供一种测序方法，使得测序方法不再依赖微球载体，解决了使用微珠法进行测序时工艺的复杂性、半导体生物芯片集成度等问题，进一步提高通量、降低测序成本。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种测序方法，包括以下步骤：提供测序芯片以及位于测序芯片上的开口限定层，开口限定层内具有至少一个开口，开口下方设置有检测模块，且开口的侧壁上修饰有至少一种核酸接头；在待测核酸分子上修饰与核酸接头碱基互补配对的核酸序列；向开口内加入扩增反应液及待测核酸分子，待测核酸分子在开口内的核酸接头处进行核酸扩增反应流程；在核酸扩增反应流程之后，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列。

本发明实施方式相对于现有技术而言，通过将核酸接头直接修饰在测序芯片上，使得测序不再依赖微球载体，创造性地解决了依赖微球的测序方法的复杂性；同时由于测序没有使用微球，半导体生物芯片的集成度可以做的更高，提高测序通量，降低了测序成本。

另外，开口限定层内具有至少两个开口，至少两个开口构成一个开口阵列。这样做的目的是：通过多个开口构成的开口阵列，通过将各个开口内的测序数据进行拼接，得到整个待测核酸分子的核酸序列。在多个开口内进行并行测序，进一步提高测序通量。

另外，依次向开口内加入预设种类的核苷酸，且基于核苷酸的种类以及与核苷酸的种类对应的检测模块的检测结果，测定待测核酸分子的核酸序列，具体包括：确定不同种类的核苷酸加入开口的顺序；按不同种类的核苷酸加入开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据检测模块的检测结果，测定待测核酸分子在该位点的核酸序列；在测定待测核酸分子在该位点的核酸序列后，重新按不同种类的核苷酸加入开口的顺序每次通入一种核苷酸，根据检测模块的检测结果，测定待测核酸分子所有位点的核酸序列。

另外，测定待测核酸分子所有位点的核酸序列，具体包括：将至少两个开口的待测核酸分子片段的核酸序列进行数据拼接，得到待测核酸分子的核酸序列。