[发明专利]地乌/地乌基原植物DNA条形码鉴定方法

说明书

本发明公开了一种地乌/地乌基原植物DNA条形码鉴定方法，包括如下步骤：提取待测样品的总DNA，以ITS2F/3R为引物对提取的总DNA序列进行PCR扩增，测序，再使用CondonCode Aligner软件进行拼接及5.8S和28S端保守序列的剪切，获得样品ITS2序列；把获得的待测样品的ITS2序列与地乌/地乌基原植物的ITS2序列进行K2P遗传距离和系统邻接树比较；如待测样品的种内最大K2P遗传距离小于其与混伪品最小种间K2P遗传距离，或经系统邻接树比较为同一支，则待测样品为真品。本发明方法能够利用ITS2序列鉴定地乌以及地乌基原植物；本发明方法能够把地乌、地乌基原植物与同属近缘混伪品进行区分，丰富了该物种DNA条形码的鉴定范围。

技术领域

本发明涉及分子鉴定技术领域，尤其涉及地乌药材及其混伪品的DNA条形码鉴定技术。

背景技术

地乌，中药名，为毛茛科植物林荫银莲花Anemoneflaccida Fr.Schmidt的根茎。林荫银莲花，又名鹅掌草。分布于陕西南部、甘肃南部、江苏南部、浙江西北部、江西、湖北西部、湖南、四川、贵州、云南西北部。为民间用药,具有解毒、祛风除湿、利筋骨之功效。常用于治疗风湿疼痛，跌打损伤等不适病症。药材的使用是非常谨慎的，因有很多同属近缘混伪品外观形状与地乌真品存在许多相似之处，所以药材市场流通过程中，难免会有混伪品混杂其中，为了用药严谨，鉴定真假地乌是必要的。

DNA条形码技术是近年来在物种鉴定领域发展起来的一种新方法，由于其具有重复性好，通用性强，不依赖于药材形态，不受环境因素影响的特点，可以弥补传统鉴定方法的不足，但是目前并没有研发出在地乌DNA条形码鉴别技术。为了保障地乌用药安全与临床疗效提供新的鉴定方法是必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地乌/地乌基原植物DNA条形码鉴定方法，以解决传统鉴定方法重复性不佳、适用范围不广等问题。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

一种地乌/地乌基原植物DNA条形码鉴定方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的总DNA，将提取的总DNA序列进行PCR扩增，测序得到峰图，再使用CondonCodeAligner软件对峰图拼接并剪切其5.8S和28S端保守序列，得到ITS2序列；

(2)把步骤(1)获得的待测样品的ITS2序列与地乌/地乌基原植物的ITS2序列进行K2P遗传距离和系统邻接树比较；

(3)如待测样品与地乌/地乌基原植物的ITS2序列的种内最大K2P遗传距离小于其与混伪品最小种间K2P遗传距离，或经系统邻接树比较为同一支，则待测样品为真品。

地乌/地乌基原植物DNA条形码鉴定方法的建立方法，包括如下步骤：

(1)用植物基因组DNA提取试剂盒提取地乌/地乌基原植物的总DNA，提取的总DNA序列经过PCR扩增，测序得到峰图，再使用CondonCodeAligner软件对峰图拼接并剪切其5.8S和28S端保守序列，得到地乌/地乌基原植物的ITS2 序列；

(2)根据地乌/地乌基原植物的ITS2序列、同属近缘混伪品DNA序列的碱基种类和排列顺序，分别计算地乌/地乌基原植物种内遗传距离及其与同属近缘混伪品的种间遗传距离，并根据地乌/地乌基原植物的ITS2序列、同属近缘混伪品DNA序列构建系统邻接树；

(3)以地乌/地乌基原植物与同属近缘混伪品最小种间K2P遗传距离大于地乌/地乌基原植物种内最大K2P遗传距离为指标，以及系统邻接树的支系为指标，得到地乌/地乌基原植物真伪鉴定方法。

优选地，所述步骤(1)PCR扩增体系如下：

PCR扩增体系以25μL为参照，包括2×PCR Mix 12.5μL，正反引物各1μL，模板DNA2μL，灭菌双蒸水8.5μL。