[发明专利]一株二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明制备的二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株Tcf 1A6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17399。本发明将二甲双胍的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，筛选出二种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株Tcf 1A6。本发明提供的细胞株Tcf 1A6分泌的单克隆抗体，对MET具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为1ng/mL），可实现对鸡肉和鸡的肝脏、饲料中MET残留量的检测，为食品中MET残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

二甲双胍（Metformin，MET）是一种降糖药，对单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的Ⅱ型糖尿病，特别是肥胖的Ⅱ型糖尿病有抑制作用。二甲双胍与胰岛素合用，可减少胰岛素用量，防止低血糖发生。其可与磺酰脲类降血糖药合用，具协同作用。二甲双胍可以促进周围组织细胞(肌肉等)对葡萄糖的利用，抑制肝糖原异生作用，因此降低肝糖输出，抑制肠壁细胞摄取葡萄糖，与胰岛素作用不同，即本品无促使脂肪合成的作用，对正常人无明显降血糖作用，因此，一般不引起低血糖。

近年来，人们对长期低水平摄入二甲双胍残留所致的各种慢性疾病和诱导病原菌产生耐药性等问题特别关注。二甲双胍可引起糖尿病昏，急性发热。有胃肠道反应。少见恶心、腹痛、腹泻等消化道症状，如在餐时或餐后服用会减少。本品治疗时出现不耐受的最初迹象时不必停药，会自行消失。在过量时，可能蓄积会出现乳酸性酸中毒。长期使用本品可降低人体对维生素B12的吸收。根据药典残留溶剂测定法要求，在食品中残留量不得超过5μg/mL。因此，建立快速有效的检测二甲双胍含量的方法具有重要意义及市场价值。采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，检测限过高，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对MET的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对二甲双胍的高特异性单克隆单体。

发明内容

本发明的目的是提供一株二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对二甲双胍具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立二甲双胍的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株Tcf 1A6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17399。

二甲双胍单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.17399的二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株Tcf 1A6分泌产生。

所述二甲双胍单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中二甲双胍残留的分析检测。

本发明提供的二甲双胍单克隆抗体杂交瘤细胞株Tcf 1A6的制备基本步骤为：由二甲双胍与对醛基苯甲酸反应得到具有羧基的产物，即半抗原4cpMET，用碳二亚胺法将半抗原4cpMET与载体蛋白偶联，即得到二甲双胍人工抗原；步骤为：

（1）半抗原4cpMET的合成，合成路线如下：

；

①将化合物对醛基苯甲酸（4-CBA）0.65 g于25 mL的圆底烧瓶中，加入纯水10mL、1M HCl溶液3mL于圆底烧瓶中；在磁力搅拌器搅拌下，向体系缓慢滴加DMF直至4-CBA完全溶解；