[发明专利]一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用

说明书

本发明提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，属于生物医学技术领域。本发明所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。本发明制备得到膀胱尿路上皮单细胞悬液在保证细胞质量的同时，还可一次性获得大量分离的尿路上皮细胞。另外，本发明所述方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于研究人员进行操作，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

哺乳动物的膀胱就像一个空心球体，由尿路上皮、固有层、逼尿肌和浆膜组成(图1A)。尿路上皮是一种特殊的层状上皮，至少由伞状细胞、中间细胞和基底细胞三种细胞类型组成(图1B)。这些细胞通过产生和维持结晶体斑块而充当尿路屏障。不同的细胞类型可以用特定的标记物来区分。Krt20标志着成熟的伞细胞，也同时表达UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb。基底细胞包括krt5标记的基底细胞和krt14标记的基底细胞，不表达Krt20和Upk。中间细胞表达Upk，不表达Krt20和Krt5(图1C)。

近年来，基于微流体的单细胞测序技术已被成功地用于了解一些正常组织中的复杂亚群及癌症。这项技术允许在单个细胞水平上研究分子差异并重建谱系层次结构，使相关研究人员能够解决有关尿路上皮细胞类型和亚型生物学的基本问题。然而由于单细胞测序需要大量的分离的、活性高(存活率90％以上)的细胞，因此，目前大多数研究尿路上皮细胞的方法，无论是分离新鲜细胞还是获得原代培养细胞，都不适合用于单细胞测序。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用。本发明所述方法可以在保证细胞质量的同时，一次性获得大量分离的尿路上皮细胞。此外，这种方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明的第一个方面，提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，从而有利于后续获得纯粹的膀胱上皮细胞，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。

其中，所述全身血液灌注具体方法包括向动物左心室内注入D-PBS溶液，D-PBS溶液进入体循环后，肝脏颜色由深变浅；当血液从右心耳流出时，打开左心耳，继续注入D-PBS溶液，直至肺完全变白或接近完全变白；观察到膀胱褪色则全身血液灌注成功。由于来自血液细胞的蛋白质会污染尿路上皮的RNA或蛋白质，因此为了获得纯粹的膀胱上皮细胞，本发明采用动物全身血液灌注方法，而非选择红细胞裂解液来消除红细胞的干扰。

其中，所述动物包括哺乳动物，进一步包括啮齿动物，所述啮齿动物包括但不限于小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠，进一步优选为小鼠。

所述膀胱孵育、酶解消化具体方法为：

S1、将采集并处理后的膀胱使用dispase II溶液进行孵育处理；然后使用PBS-EDTA溶液冲洗2～3次；

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育经步骤S1处理后的膀胱；

S3、收集步骤S2中的孵育处理后的PBS-EDTA溶液，离心，取上清液加入胰蛋白酶消化细胞。

本发明的第二个方面，提供上述制备方法制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液。采用本发明制备方法得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液，其中膀胱尿路上皮单细胞活性高，品质好，且细胞分离度较高，有利于进行单细胞测序。

本发明的第三个方面，提供上述制备方法和/或上述膀胱尿路上皮单细胞悬液在单细胞测序中的应用。