[发明专利]一种以ATP为佐剂的HPV纳米疫苗组合物及其制备方法

说明书

本发明提供了一种以ATP为佐剂的HPV纳米疫苗组合物及其制备方法，所述组合物包括E7‑PLGA纳米疫苗和ATP佐剂，且所述HPV纳米疫苗组合物中ATP的浓度为10‑100μM。腺苷三磷酸（ATP）是机体最重要的胞内代谢产物之一，利用ATP作为内源性佐剂，安全性更高、副作用更小。并且，经过多方实验证实，ATP作为新型佐剂，大大促进了E7‑PLGA纳米疫苗的肿瘤免疫治疗。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种以ATP为佐剂的HPV纳米疫苗组合物及其制备方法。

背景技术

宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤类型，在全球范围内其发病率仅次于女性乳腺癌，而宫颈癌的发生与持续感染高危型人乳头瘤病毒（HPV）有关。目前，已经批准的三种HPV预防性疫苗能够诱导机体产生抗体应答并有效预防常见的高危型HPV感染，但预防性疫苗对已确定的HPV感染者或HPV引起的相关肿瘤缺乏治疗效果。因此，迫切需要开发有效的HPV治疗性疫苗，以用于那些已被HPV感染的人群，降低她们的HPV 相关疾病的发生率。

HPV治疗性疫苗主要通过递呈抗原给抗原呈递细胞，激活细胞免疫应答并特异性地清除病毒和被病毒感染的细胞。传统的HPV治疗性疫苗主要包括活载体疫苗、肽疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗。由早期基因表达的E6和E7癌蛋白是开发有效治疗性疫苗的理想靶点，并且HPV癌蛋白衍生的肽疫苗已经在临床试验中已表现出有希望的结果。一项Ⅱ期临床试验显示，HPV16合成长肽（SLP）疫苗能在低度病变的宫颈中形成长期免疫反应，诱导HPV16 特异性的T细胞反应，维持时间长达1 年。尽管基于E6/E7 SLP疫苗在患者中引起强烈的CD4+1型T辅助（Th1）反应，但诱导较弱的CD8+T应答，在HPV16+宫颈癌患者中效果不佳。树突状细胞（DCs）是最有效的抗原提呈细胞，DCs的激活和成熟是诱导有效的基于CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答的先决条件。

随着纳米技术的不断发展，新型的纳米颗粒疫苗被认为是一种激活DC、促进DC成熟并增强肿瘤免疫疗法有前景的策略。 在肿瘤免疫治疗中纳米颗粒表现出众多优势，例如易于功能性修饰，保护抗原免受体内酶的降解，在注射部位形成“抗原储存库”持续释放抗原，促进抗原进入抗原提呈细胞，增加抗原的溶酶体逃逸等。与游离的抗原相比，纳米疫苗更有利于增强抗肿瘤免疫反应。但单独纳米颗粒疫苗的效果仍然有限，需要有效的佐剂进一步增强纳米颗粒的肿瘤免疫治疗效应。因此，开发新型的佐剂以增强纳米颗粒疫苗的肿瘤免疫治效果是有前景的。

随着不断地探索和开发，以机体内源性物质作为新型的疫苗佐剂逐渐受到关注，内源性佐剂是机体自身具备的，利用内源性佐剂安全性更高、副作用更小。腺苷三磷酸（ATP）是机体最重要的胞内代谢产物之一，也是一种重要的信号分子。近年来研究表明，化疗药物在诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD）的过程中，伴随一系列特殊的分子事件发生，包括钙网蛋白(calreticulin, CRT)、热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)从内质网转位到细胞膜表面，ATP及高迁移组蛋白(high mobility group box, HMGB1)释放到胞外。释放的ATP为募集DCs及前体提供一种“Find-Me”的信号，ATP可与大量表达在DCs膜上的P2X或P2Y嘌呤受体结合并激活受体，进而活化NALP3-ASC-炎性小体，导致IL-1β的释放，而IL-1β能促进分泌IFN-γ的CD8+T细胞的活化，增加肿瘤免疫治疗。因此，ATP被认为是有前景的疫苗佐剂。

发明内容

本发明的目的是通过有效的佐剂进一步增强纳米颗粒的肿瘤免疫治疗效应，从而提供了一种以ATP为佐剂的HPV纳米疫苗组合物及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种以ATP为佐剂的HPV纳米疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将HPV16 E7_44-62冻干肽溶解于无菌水中，使其形成第一水相溶液（W1）；