[发明专利]一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体及其构建方法。首先构建含有诱导型tac启动子和绿色荧光蛋白gfp基因的表达载体，将目的蛋白基因插入该载体中，使目的蛋白和绿色荧光蛋白GFP融合表达，再将此载体转入细菌中并诱导表达，通过在荧光显微镜下观察细菌细胞中绿色荧光的分布情况来确定目的蛋白的空间定位。本发明可实现在活体细胞中实时直观地检测目的蛋白的空间定位，方便快捷。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体及其构建方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的最终执行者，蛋白质亚细胞定位与其功能密切相关，蛋白质在细胞中的正确定位是细胞系统高度有序运转的前提保障。研究细胞中蛋白质定位的机制和规律，预测蛋白质的亚细胞定位，对于了解蛋白质的性质和功能、了解蛋白质之间的相互作用及探索生命的规律和奥秘具有重要意义。将目的蛋白与荧光蛋白融合，利用荧光蛋白的荧光特性检测目的蛋白质的空间定位是一种快捷灵敏的研究蛋白质空间定位的方法。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光，这使得绿色荧光蛋白GFP作为标签蛋白在生物技术领域被广泛使用。GFP介导的融合蛋白标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，此标签技术可应用于细胞内基因表达水平的检测、蛋白质的细胞内原位示踪与定位等。

细菌属于原核生物，其胞内的蛋白定位也有多种情况，如膜上、菌体端点附近、细胞质中、周质空间中等，这些不同的定位与蛋白的功能发挥有密切联系。目前常见的蛋白质空间定位载体多是针对真核生物细胞设计的，针对原核细胞的蛋白定位载体较少。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体及其构建方法，本发明的表达载体除了可以直观检测细菌中一般蛋白的空间定位，还适用于表达量低的蛋白、毒性蛋白或细菌生长特定阶段表达的蛋白的定位观察，方便实用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体，包括诱导型表达元件、绿色荧光蛋白gfp基因、接合转移位点、多克隆位点和编码目的蛋白的基因，所述绿色荧光蛋白gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述编码目的蛋白的基因插入在所述多克隆位点上，所述目的蛋白包括仅在细菌生长特定阶段表达的蛋白。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述诱导型表达元件由tac启动子和lacI操纵基因组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技术方案的基础上，所述多克隆位点位于诱导型表达元件和gfp基因之间，即目的蛋白基因位于诱导型表达元件和gfp基因之间，实现目的蛋白与GFP蛋白的融合表达。

第二方面，本发明提供了一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到pBBR1MCS-5上除去lacZ基因以外的DNA片段；

S2、以pVLT33质粒为模板，扩增得到lacI基因+tac启动子；

S3、用限制性内切酶对步骤S1所述DNA片段和步骤S2所述lacI基因+tac启动子进行酶切，然后连接得到表达载体pBBRlacITac；

S4、以pBBR1-gfp质粒为模板，扩增得到gfp基因；

S5、用限制性内切酶对表达载体pBBRlacITac和gfp基因进行酶切，然后连接得到表达载体pBBRlacITac-gfp；

S6、以细菌基因组总DNA为模板，扩增得到编码目的蛋白的基因x；

S7、将编码目的蛋白的基因x连接到表达载体pBBRlacITac-gfp上，得到表达载体pBBRlacITac-x-gfp。