[发明专利]一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体及其构建方法有效
| 申请号： | 201910955767.2 | 申请日： | 2019-10-09 |
| 公开（公告）号： | CN110656119B | 公开（公告）日： | 2021-05-25 |
| 发明（设计）人： | 崔格特 | 申请（专利权）人： | 武汉博欧特生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/78;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;C12R1/19;C12R1/40 |
| 代理公司： | 武汉红观专利代理事务所(普通合伙) 42247 | 代理人： | 张文俊 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 观察 细菌 蛋白 定位 表达 载体 及其 构建 方法 | ||
1.一种用于观察细菌蛋白定位的表达载体，包括诱导型表达元件、绿色荧光蛋白gfp基因、接合转移位点、多克隆位点和编码目的蛋白的基因，其特征在于：所述绿色荧光蛋白gfp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述编码目的蛋白的基因插入在所述多克隆位点中，所述目的蛋白包括仅在细菌生长特定阶段表达的蛋白；
所述用于观察细菌蛋白定位的表达载体的构建方法，包括如下步骤：
S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到pBBR1MCS-5上除去lacZ基因以外的DNA片段；
S2、以pVLT33质粒为模板，扩增得到lacI基因+tac启动子；
S3、用限制性内切酶对步骤S1所述DNA片段和步骤S2所述lacI基因+tac启动子进行酶切，然后连接得到表达载体pBBRlacITac；
S4、以pBBR1-gfp质粒为模板，扩增得到gfp基因；
S5、用限制性内切酶对表达载体pBBRlacITac和gfp基因进行酶切，然后连接得到表达载体pBBRlacITac-gfp；
S6、以细菌基因组总DNA为模板，扩增得到编码目的蛋白的基因x；
S7、将编码目的蛋白的基因x连接到表达载体pBBRlacITac-gfp上，得到表达载体pBBRlacITac-x-gfp。
2.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体，其特征在于：所述诱导型表达元件由tac启动子和lacI操纵基因组成，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体，其特征在于：所述多克隆位点位于诱导型表达元件和gfp基因之间。
4.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体，其特征在于：所述表达载体pBBRlacITac-gfp的完整核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
5.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体，其特征在于：步骤S3中所述限制性内切酶为XhoI和NdeI，步骤S5中所述限制性内切酶为XhoI和HindIII。
6.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体，其特征在于：所述编码目的蛋白的基因x序列中不含翻译终止密码子，扩增所述gfp基因时在其末端引入翻译终止密码子。
7.如权利要求1所述的用于观察细菌蛋白定位的表达载体在细菌蛋白空间定位的检测中的应用，其特征在于：将所述表达载体导入细菌中诱导表达，然后在荧光显微镜下观察细菌细胞中绿色荧光的分布情况来确定目的蛋白的空间定位。
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