[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌及其用途

说明书

本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌，是通过从地表下6cm附近的土壤中筛选得到。本发明还公开了利用所述解淀粉芽孢杆菌生产γ‑氨基丁酸的方法，包括以下步骤：(1)将所述解淀粉芽孢杆菌于牛肉膏蛋白胨培养基液体内进行种子液培养；(2)将步骤(1)获得的种子液接种于发酵培养基内进行发酵培养；(3)用Berthelot比色法对步骤(2)获得的发酵液上清进行定性检测；(4)RP‑HPLC纯化步骤(3)中的发酵液。本发明提供了一种高产γ‑氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌，能高产GABA，菌株抗逆性较强，菌种生活力维持时间长等优点，可长久保藏。同时建立了Berthelot比色法和RP‑HPLC法对γ‑氨基丁酸进行快速地测定和纯化制备。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产γ-氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌及其用途。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)，白色或微黄色结晶状粉末，易潮解，易溶于水，不溶于有机溶剂，无旋光性，分子式为C4H9NO2，分子量103.12。其广泛分布于自然界，从微生物到植物和动物。γ-氨基丁酸存在于哺乳动物中枢神经系统中，其中脑组织中包含0.1—0.6mg/g，在动物体内具有重要的生理功能，如降血压、抗焦虑、安定神经、抑制肥胖、利尿等作用。此外，GABA可以改善血浆生长激素的浓度和脑内蛋白质合成的速率，对动物机体正常的生理功能起着重要的调节作用。

GABA广泛分布在动植物体内，目前，获得GABA方法主要是化学合成法和生物合成法。化学合成过程中使用多种危险甚至有毒性、腐蚀性化学试剂，反应条件剧烈，成本高，环境污染严重等缺点，使提取出的GABA难以用于食品保健、医药等行业。微生物发酵相对于化学合成法和植物富集法而言，具有发酵周期短，反应条件温和，环境污染小、产率高等优点，因此有良好的发展前景。而且生物合成过程中基本不添加化学试剂，主要是利用发酵菌株本身的酶系系统来催化合成GABA。其中谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase，GAD)是调控GABA合成的关键酶，并且底物专一性强。发酵法生产GABA的菌株主要有大肠杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等。大肠杆菌虽然其转化率较高，但后期处理产生的内毒素过程繁琐及发酵过程中需添加抗生素等缺点限制其应用，野生的乳酸菌、酵母菌其转化率均偏低。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高产γ-氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌，能高产GABA，菌株抗逆性较强，菌种生活力维持时间长等优点，可长久保藏。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种高产γ-氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌，筛选方法包括以下步骤：(1)取地表下6cm附近的土壤，加入100mL蒸馏水，于37℃条件下将土壤和蒸馏水混合均匀后，混合液于80℃孵育1h；(2)取100μL浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的土壤稀释液滴于LB平板中央，涂布均匀，然后于37℃培养箱中培养；(3)分离出颜色为污白色或微带黄色且边缘不规整，呈现典型“火山口”状的单菌落，接种于LB培养基，于37℃培养箱培养12h；(4)对菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检，筛选出呈蓝紫色杆状的菌；(5)将步骤(4)获得的解淀粉芽孢杆菌接于牛肉膏蛋白胨培养基液体内进行种子液培养，振荡培养13h后，接种于LandⅢ培养基内进行发酵培养，30℃振荡培养48h；(6)用Berthelot比色法对步骤(5)获得的发酵液上清进行定性检测，筛选得到所述高产γ-氨基丁酸的解淀粉芽孢杆菌。

所述解淀粉芽孢杆菌16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。