[发明专利]一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法

说明书

本发明公开了一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法，属于食品生物技术领域。本发明通过筛选获得一株高产磷脂酶D的链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌SP.005，保藏编号为CCTCC M 2019558。通过对该肉桂链霉菌进行斜面、种子、发酵三级培养，并在此条件下，生产磷脂酶D酶，经酶活测定方法，其酶活可达15.66U/mL以上，最后将发酵液经分离纯化制得磷脂酶D酶粉。该生产工艺不仅有效地提高了产量，且所生产出的磷脂酶D具有较高的磷酰基转移活性，可用于进行磷脂酰丝氨酸的高效生产。

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体地涉及一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法。

背景技术

近年来，随着人口老龄化不断加剧，老年痴呆患者人数逐年增加，对于含一定效果的功能性食品的需求日益旺盛。磷脂酰丝氨酸(PS)对于老年痴呆有非常好的保健功效，但是天然的磷脂酰丝氨酸在自然界中数量极少，而磷脂酶D(PLD)作为合成PS的催化剂，是制约其实现量产的关键因素。

植物来源的PLD的酸性范围一般在5～6之间，微生物来源的PLD在4～8之间。而且，微生物来源的PLD相比于植物来源的PLD具有更强大的转酯能力与更低的底物特异性。其中，尤以源自链霉菌属的PLD的转酯能力尤为突出。上世纪70年代起，国内外许多学者开始寻找微生物源磷脂酶D，以扩大酶源。但微生物发酵周期长，酶学性质差异大，在实际生产和工业应用中存在较大困难。2013年胡飞研究表明苍白杆菌产PLD的酶活可达7.35U/mL，但受限于其微生物来源属杆菌。2015年，梁丽敏等所发表的《产磷脂酶D链霉菌发酵条件优化》表明链霉菌酶活达到3.5U/mL。微生物酶转化法具有简单、高效、可控的特点且反应温和、低碳环保，得到的产品也较为安全，是制备PLD的不二选择。但现有微生物产磷脂酶D方法周期长、产量低，难以实现工业化大规模生产。因此筛选获得高效的产PLD菌种非常有必要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明使用的菌株，是本实验室由豆油厂附近的土壤中筛选分离得到的一株可以高产磷脂酶D的链霉菌，分类命名为肉桂链霉菌SP.005，该肉桂链霉菌SP.005藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，藏编号为CCTCC M 2019558。

一种所述肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法，具体包括以下步骤：

(1)斜面培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～20g/L，琼脂15～20g/L，K₂HPO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。

(2)种子培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～15g/L，K₂HPO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)斜面培养得到的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为28-32℃，摇床转速180-220rpm，培养时间2-5天，得到种子培养液。