[发明专利]一种肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法及磷脂酶D活性测定方法

权利要求书

1.一种肉桂链霉菌，该肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)为SP.005，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2019558。

2.一种如权利要求1所述肉桂链霉菌产磷脂酶D的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)斜面培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～20g/L，琼脂15～20g/L，K₂HPO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得斜面培养基，将肉桂链霉菌接种到斜面培养基上，培养72h，得到斜面培养的肉桂链霉菌。

(2)种子培养：采用葡萄糖10～15g/L，酵母浸膏10～20g/L，蛋白胨5～15g/L，K₂HPO₄0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2.5g/L，在121℃条件下灭菌30min，获得种子培养基，将步骤(1)斜面培养得到的肉桂链霉菌，接种到种子培养基上进行培养。培养温度为28-32℃，摇床转速180-220rpm，培养时间2-5天，得到种子培养液。

(3)基础发酵培养：采用葡萄糖10～25g/L，酵母浸膏5～15g/L，蛋白胨10～20g/L，K₂HPO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～2.5g/L，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，于121℃条件下灭菌30min，制备基础发酵培养基，将步骤(2)得到的种子培养液接种到基础发酵培养基上培养，接种量为基础发酵培养基体积的1-3％，培养温度为28-32℃，搅拌速度为180-220rpm，通风量为0.2-0.6L/min，培养时间2-5天，获得发酵培养液。

(4)分离纯化得到磷脂酶D：将步骤(3)获得的发酵培养液进行过滤，除去肉桂链霉菌菌体，获得发酵液上清液，经超滤后除去盐和杂蛋白，再经体积浓度为25％乙醇水溶液沉淀，在6000rpm转速下离心20min，获得磷脂酶D沉淀，然后将所述磷脂酶D沉淀进行冷冻干燥，即获得磷脂酶D酶粉。

3.一种磷脂酶D活性测定方法，其特征在于，将权利要求2中磷脂酶D沉淀溶解于浓度为4mg/mL PC的乙醚溶液和浓度为0.2g/mL丝氨酸的醋酸缓冲溶液混合，于30℃、200rpm下反应4h，得到混合溶液，将混合溶液静置，取有机层进行蒸发，再将蒸发后的产物溶解于三氯甲烷和甲醇按体积比为2:1的混合液中，通过HPLC-ELSD法测定磷脂酰丝氨酸的含量。所述醋酸缓冲溶液的pH为5.5，浓度为0.02mol/L。