[发明专利]检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法

权利要求书

1.一种检测脐带间充质干细胞影响T淋巴细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分组培养：将获取的T淋巴细胞液分为共培养组和对照组，向共培养组中加入CD3抗体、CD28抗体和脐带间充质干细胞，向对照组中加入与共培养组等量的CD3抗体和CD28抗体，将共培养组和对照组放置于相同条件下培养2～7天；

刺激T淋巴细胞：向共培养的细胞液中加入Cocktail，反应2～4h，收集悬浮细胞；

检测：检测所述悬浮细胞中细胞活化标记CD4、CD8、Foxp3、IFN-r、IL-4、IL-17、IL-21、颗粒酶B的表达丰度；根据共培养组和对照组中细胞活化标记的表达丰度判断脐带间充质干细胞对T淋巴细胞分化的影响。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，所述T淋巴细胞的获取方法包括以下步骤：

稀释：将血液与生理盐水混合得到稀释血液；

离心：将稀释血液加至淋巴细胞分离液中，离心；

分离：离心后，去除上层液体，保留沉淀，加入PBS重悬，离心，舍弃上层液体，保留沉淀，加入1640培养基和5～20％的血清重悬，得到T淋巴细胞液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稀释步骤中，所述血液与所述生理盐水的体积比为1:(2～3)。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中，所述淋巴细胞分离液与血液的体积比为(1～2)：1。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心步骤中，离心温度为18～22℃，离心时间为18～22min，升速为7，降速为0。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离步骤中，离心温度为4±1℃，离心时间为7～9min，升速为9，降速为9。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分组培养步骤中共培养组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×10⁶个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，再加入脐带间充质干细胞液，所述T淋巴细胞与所述脐带间充质干细胞的数量比为(48～52)：1，进行共培养；

所述分组培养步骤中对照组的具体操作为：将T淋巴细胞液加入96孔板，T淋巴细胞液的浓度为5～6×10⁶个/mL，每孔加入150～250μL，每孔加入浓度为2.5～5μg/mL的CD3抗体和2.5～5μg/mL CD28抗体，进行培养。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺激T淋巴细胞步骤中，所述Cocktail包括佛波酯、离子霉素和布雷非德菌素A。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述佛波酯终浓度为19～21ng/mL，离子霉素浓度为0.8～1.2μg/mL，布雷非德菌素A浓度为14～16μg/mL。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述Cocktail的添加量为3～5μg/孔。