[发明专利]一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，包括以下组成：

（1）包被有1 μg·mL^-1抗原OLA-A-OVA的反应板；-A-表示-CH=CH-CH=CH-COO-；

抗原OLA-A-OVA为：

（2）铕标记的喹乙醇单克隆抗体溶液：含0.5 ng·mL^-1的Eu³⁺-OLA-mAb，质量百分含量为1%BSA，质量百分含量为0.2%叠氮化钠，基础缓冲体系为0.01 mol·L^-1，pH=7.4的磷酸盐缓冲液与等体积的甘油混合而成；

（3）喹乙醇标准品母液1 μg·mL^-1；

（4）反应增强液：含0.27 mmol·L^-1 а-噻吩甲酰三氟丙酮，0.5 mmol·L^-1三辛基氧化膦，体积分数为0.05%无水乙醇，体积分数为5.9%冰乙酸，体积分数为0.25%的TritonX-100，6.8 mmol·L^-1的邻苯二甲酸氢钾，pH为3 .0，余量为去离子水；

（5）浓缩洗液：100 mmol·L^-1、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，且该缓冲液中含有体积百分比浓度为0.5%的吐温20。

2.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，反应板为96孔板，材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

3.根据权利要求1所述的一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，铕标记的喹乙醇单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）喹乙醇半抗原的合成

（1.1）将1mmol喹乙醇溶于2-5mLTHF中， 0℃下加入1.0-1.2 mmol NaH，搅拌0.5-2小时，后加入1mmol 的5-溴-2,4-二烯戊酸乙酯，65℃下反应6-8小时，待反应完全后，加入30-50mL H₂O，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，旋干溶剂，经柱层析分离得到OLA-A₁，A₁为-CH=CH-CH=CH-COOCH₂ CH₃；

（1.2）将1mmol OLA-A₁溶于8-12mL甲醇与水的混合液中，其中，甲醇与水的体积比为1:1，加入氢氧化锂1-1.5mmol，搅拌，室温下反应1-3h；反应完全后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH等于5-6，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得产物OLA-A，-A为-CH=CH-CH=CH-COOH；具体的合成路线如下：

；

（2）喹乙醇人工抗原的合成

取0.04 mmol OLA-A溶于0.8 -1.0mL DMF中，加入0.04 mmol N-羟基琥珀酰亚胺和0.04 mmol二环己基碳二亚胺，室温下避光搅拌反应10-12 h后2000 r/min离心10 min，离心后上清液为a液；

称取20 mg OVA溶于5 mL 0.01 mmol/L，pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，此为b液；

4 ℃下将0.6 mL a液逐滴加入到b液中，4 ℃搅拌反应过夜；次日转入透析袋内，0.01mmol/L，pH=7.4的磷酸盐缓冲液透析2天，离心弃沉淀，得到交联产物，命名为OLA-A-OVA，-A-表示-CH=CH-CH=CH-COO-；具体的合成路线如下：

；

（3）小鼠免疫：

选择6-8周龄BALB/C 雌性小鼠，将制备的免疫原OLA-A-OVA与等体积弗氏完全佐剂采用注射器加压充分混合乳化后，腹部和腋下多点注射，后每间隔21天进行加强免疫，3次加强免疫后采血测定效价，效价采用间接ELISA方法测定，当效价不再明显升高时进行末免，末免3 天后进行细胞融合，免疫过程中第一次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫采用弗氏不完全佐剂，末免不使用佐剂，直接免疫原注射免疫；

（4）细胞融合与细胞株筛选：

在末免3天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照5～10：1的比例进行融合，间接ELISA筛选阳性孔，并对阳性孔进一步利用间接竞争ELISA测定阳性孔的抑制效果，对抑制效果好的杂交瘤细胞用有限稀释法进行3~4次克隆，筛选获得杂交瘤细胞株；

向BALB/C小鼠腹腔注射降植烷，0.3 mL/只，7～10天后同法注射杂交瘤细胞株细胞，待小鼠腹腔明显胀大后抽取腹水，离心除去油脂沉淀后，即得小鼠腹水；

腹水纯化后，得到抗喹乙醇单克隆抗体；

（5）Eu³⁺-OLA-mAb的制备

A. 5 mL纯化好的喹乙醇单克隆抗体与0.5 mL 0.01 mol·L^-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液 1:1混合；

B．称取3.0 mg环化二乙烯三胺五醋酸酐，加入90 μL DMSO溶解；

C. 将90 μL步骤 B中的溶液缓慢滴加到步骤A中溶液，用0.125 mol·L^-1 NaOH调pH至9.0，室温避光放置2 h；

D. 将步骤C最终的反应液转移至透析袋中，0.01 mol·L^-1 pH=7.4 磷酸盐缓冲液透析过夜；

E. 准确称取0.242 g EuCl₃·6H₂O于20 mL水中配成3.3×10^-2 mol·L^-1 EuCl₃溶液；

F. 取100 μL 步骤E中的溶液加入步骤D中，室温避光反应3 h后置于透析袋中透析24h ~36 h，分装保存于-20 ℃，即得到铕标记喹乙醇单克隆抗体Eu³⁺-OLA-mAb。