[发明专利]一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用，本发明制备的抗喹乙醇单克隆抗体特异性强，制备的试剂盒具有较高的精密度和准确度，而且该试剂盒对喹乙醇有高度的特异性；该试剂盒能够对水和饲料中的喹乙醇进行定性和定量检测，样品预处理过程简单，方便快捷，检测准确度高；本发明的试剂盒为化学发光检测试剂盒，具有灵敏度高，准确率高、背景干扰不明显，检测时间短、操作方便等特点，而且是基于磁珠为载体的化学发光免疫分析，将化学发光免疫分析的优点有效发挥，检测结果可以通过常规的化学发光分析仪进行读数，具有很好的兼容性，应用价值大，市场前景广，能够有效推动喹乙醇快速检测技术的发展。

技术领域

本发明属于生物分析技术中的磁珠免疫分析技术领域，具体涉及一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用。

背景技术

喹乙醇(Olaquindox，OLA)是一种抗菌促生长剂，曾广泛应用于水产养殖，一度被称为“水产瘦肉精”。喹乙醇的毒副作用不容小觑，存在明显的遗传毒性和蓄积毒性，因此国内外相继制定了严格的使用规范和残留限量标准。如美国和欧盟禁止使用喹乙醇，日本规定喹乙醇在动物组织和内脏中的最大残留限量(MRL)为300μg·kg^-1，我国农业部在2001年发布的第168号公告《饲料药物添加剂使用规范》中规定饲料中的添加量不得高于50mg·kg^-1，同时规定禁止在鱼、禽及体重超过35kg猪的养殖过程中使用。尽管如此，抗菌促生长效果好且廉价的喹乙醇目前仍存在违规添加使用的现象。因此，加强喹乙醇的检测监督，特别是加强喹乙醇检测技术的研究极为必要。

喹乙醇的残留检测方法，主要包括传统的仪器分析和免疫分析两大类。其中仪器法主要包括光谱法、色谱法以及液质联用技术等，仪器分析准确度高、精密度强，但其样品前处理过程复杂繁琐、耗时长、需要专业技术人员操作、仪器试剂等价格昂贵，无法在基层得到极大推广。免疫分析技术凭借着其高效、快速、高灵敏度以及高特异性等优势广泛应用于小分子药物残留检测中。目前常用的免疫检测方法主要包括酶联免疫检测法、胶体金免疫层析、荧光免疫分析等，但存在灵敏度不理想，假阳性和假阴性等问题。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明提供了一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种喹乙醇的磁免疫化学发光检测试剂盒，包括反应板，喹乙醇磁标抗体，喹乙醇酶标半抗原，磁标抗体稀释液，酶标半抗原稀释液，喹乙醇标准品母液，化学发光底物A液，化学发光底物B液，浓缩洗涤液；

所述酶标半抗原是辣根过氧化物酶标记的喹乙醇半抗原；所述喹乙醇磁标抗体是磁珠标记的喹乙醇单克隆抗体；

所述喹乙醇单克隆抗体是由喹乙醇半抗原与牛血清白蛋白偶联后制备得到人工抗原，然后免疫小鼠后通过细胞融合、筛选、抗体的制备、纯化获得的；

喹乙醇半抗原由以下步骤制备得到：

(1.1)将1mmol喹乙醇溶于2-5mLTHF中，0℃下加入1.0-1.2mmol NaH，搅拌0.5-2小时，后加入1mmol的5-溴-2,4-二烯戊酸乙酯，65℃下反应6-8小时，待反应完全后，加入30-50mL H₂O，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，旋干溶剂，经柱层析分离得到OLA-A₁，A₁为-CH＝CH-CH＝CH-COOCH₂CH₃；

(1.2)将1mmol OLA-A₁溶于8-12mL甲醇与水的混合液中，其中，甲醇与水的体积均为5mL)，加入氢氧化锂1-1.5mmol，搅拌，室温下反应1-3h；反应完全后，用1mol/L的盐酸溶液调节pH等于5-6，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得产物OLA-A，-A为-CH＝CH-CH＝CH-COOH；具体的合成路线如下：