[发明专利]一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用

说明书

本发明提供了一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用。本发明方法采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，酪氨酸侧链硫酸根采用新戊基作为保护基，半胱氨酸侧链采用三苯甲基和/或乙酰胺甲基作为保护基；然后通过合适的试剂除去侧链保护基和将目标多肽从树脂裂解下来并纯化，即得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽。本发明有助于我们研究酪氨酸硫酸化修饰对多肽生物活性的影响及相关机理，为相关疾病诊断及治疗奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及多肽合成制备技术领域，具体涉及一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用。

背景技术

蛋白质酪氨酸硫酸化(protein tyrosine sulfation,PTS)是一个普遍的翻译后修饰，无机硫酸盐与生物分子的结合在生物体系中具有重要作用。有研究者对Anophelin蛋白进行了双重硫酸化修饰，结果显示，这种修饰导致其凝血酶抑制活性增强了100倍(Watson,E.E.；Liu,X.；Thompson,R.E.ACS.Cent.Sci.2018,4,468-476)。因此，蛋白质酪氨酸硫酸化修饰对其生物活性的影响尤为重要。

芋螺毒素被誉为“海洋药物宝库”，它是一种来源于海洋芋螺中具有生物活性的环状多肽化合物。截至目前，已经从海洋芋螺中发现了上千种芋螺毒素，其药用活性已经成为当今生物医药领域研究的热点之一，其中ω-芋螺毒素MVIIA(齐考诺肽)已被美国FDA批准上市。α-芋螺毒素是人们最早发现的芋螺毒素种类，一般由12～19个氨基酸组成。α-芋螺毒素的半胱氨酸序列模式为CC-C-C，其二硫键成键方式为Cys1-Cys3和Cys2-Cys4。α4/7-芋螺毒素是α-芋螺毒素的亚家族，其二、三及三、四位半胱氨酸间氨基酸残基数量分别为4与7。α4/7-芋螺毒素能特异性阻断神经型乙酰胆碱受体，因此可通过研究它们之间的相互作用来揭示其在相关神经疾病，如阿尔兹海默症等诊疗中的应用潜能。

α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA和PnIB分别来源于芋螺Conusepiscopatus，Conus anemones以及Conus pennaceu。其中，α-芋螺毒素EpI能特异性地与α3β2、α3β4乙酰胆碱受体相互作用，近期的研究表明它也很可能选择性抑制α7受体(Nicke.A.FEBS.Lett,2003,554,219-223.)，具有潜在的药用价值，在此之前，有其他研究者通过高分辨质谱等手段发现EpI的15号位酪氨酸残基会伴有酪氨酸硫酸化修饰(Loughnan,M.J.Biol.Chem.1998,273,15667-15674.)，但该修饰对EpI与乙酰胆碱受体间相互作用的影响尚不明确。与EpI类似，α-芋螺毒素PnIA和PnIB的15号位酪氨酸残基也存在硫酸化修饰，研究者试图通过化学合成的方法来得到含硫酸化修饰的PnIA和PnIB，但并未成功(Wolfender,J.L.J.Mass.Spectrom.1999,34,447-454.)。此外PnIA和PnIB均能特异性地与乙酰胆碱α3β2，α7受体结合，其中PnIA对α3β2受体抑制能力更强，而PnIB则能更好的抑制α7受体，同时PnIA的某些单个关键氨基酸残基对其乙酰胆碱受体靶向性有决定性影响(Luo,S.Biochemistry.1999,38,14542-14548.)，因此它是一种非常有潜力的药用毒素多肽。此外，α-芋螺毒素AnIA、AnIB、AnIC也存在酪氨酸硫酸化修饰，研究表明AnIB的16号位酪氨酸残基带有硫酸化修饰时能增强其与乙酰胆碱α7和α3β2受体的亲和力，其中对α7亲和力的影响更加显著(Wolfender,J.L.J.Med.Chem.2004,47,1234-1241)。因此，我们推测硫酸化修饰在α-芋螺毒素的乙酰胆碱亚型选择性及亲和力方面扮演着重要的作用。