[发明专利]一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法及其应用

权利要求书

1.一种含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）采用Fmoc固相多肽合成法，以Fmoc氨基树脂为载体，根据包含酪氨酸硫酸化修饰位点的多肽序列，从C端到N端依次缩合Fmoc保护氨基酸，获得线性肽氨基树脂；其中，所述多肽序列中均包含形成二硫键的两对半胱氨酸；两组Fmoc保护半胱氨酸侧链分别采用三苯甲基和乙酰胺甲基作为保护基，同组的半胱氨酸连接相同保护基；Fmoc保护酪氨酸侧链的硫酸根采用新戊基作为保护基；

（2）将所得线性肽氨基树脂进行切割，使肽链从Fmoc氨基树脂上脱下并脱除除新戊基和乙酰胺甲基保护基之外的侧链保护基；经过滤、旋干、萃取、离心、冻干，得到线性肽粗品；进一步分离纯化，得到线性肽；

（3）将步骤（2）所得的线性肽进一步裂解；脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽，形成第一对二硫键；脱除半胱氨酸侧链的乙酰胺甲基保护基的同时进一步氧化折叠，形成第二对二硫键；分离纯化，得到含酪氨酸硫酸化修饰的多肽；其中，脱除酪氨酸侧链的新戊基的试剂为NH₄HCO₃溶液、NH₄HCO₃和K₃Fe(CN)₆混合液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或纯水溶液。

2.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的NH₄HCO₃溶液为0.1mol/L、pH=8.4的NH₄HCO₃溶液；

步骤（3）中所述的NH₄HCO₃和K₃Fe(CN)₆混合液为10mmol/L K₃Fe(CN)₆、0.1mol/LNH₄HCO₃、pH=8.4的混合液；

步骤（3）中所述的磷酸盐缓冲液为0.1mol/L、pH=6.5的磷酸盐缓冲液；

步骤（3）中所述的Tris缓冲液为50mmol/L、pH=8的Tris缓冲液。

3.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA或PnIB；EpI、AnIA、AnIB、AnIC、PnIA、PnIB的氨基酸序列分别如下所示，其中sY表示酪氨酸硫酸化修饰位点：

EpI[Y15sY]：GCCSDPRCNMNNPDsYC；

AnIA[Y14sY]：CCSHPACAANNQDsYC；

AnIB[Y16sY]：GGCCSHPACAANNQDsYC；

AnIC[Y16sY]：GGCCSHPACFASNPDsYC；

PnIA[Y15sY]：GCCSLPPCAANNPDsYC；

PnIB[Y15sY]：GCCSLPPCALSNPDsYC。

4.根据权利要求3所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：

在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，当所述的多肽为α-芋螺毒素EpI、AnIC、PnIA或PnIB时，所用的试剂为NH₄HCO₃溶液；当所述的多肽为α-芋螺毒素AnIA或AnIB时，所用的试剂为K₃Fe(CN)₆和NH₄HCO₃混合液；

在所述的脱除酪氨酸侧链的新戊基的同时氧化折叠所得线性肽步骤中，反应条件为室温下振荡反应12～96h。

5.根据权利要求1所述的含酪氨酸硫酸化修饰的多肽合成方法，其特征在于：

在所述的脱除半胱氨酸侧链的乙酰胺甲基保护基的同时进一步氧化折叠步骤中，具体操作为：将脱除酪氨酸侧链的新戊基后的溶液进行酸化处理，加入I₂/MeOH溶液或I₂/50%AcOH溶液，反应，清除过量的I₂。