[发明专利]一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶的方法

说明书

本发明属于蛋白纯化领域，具体公开了一种同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶、α‑淀粉酶的方法。首先采用硫酸铵盐析的方法确定每种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度，而后将各梯度的饱和酶液经透析后上柱于Q Beads 6 FF阴离子柱，再用50‑400mM的NaCl溶液梯度洗脱，流速控制在1‑5mL/min，收集各组分酶液浓缩测定其蛋白含量和酶活，最后进行SDS‑PAGE电泳确定纯化效果。

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，特别涉及一种同步纯化酶粉中脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三种蛋白的方法。

背景技术

脂肪酶，是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于能源、油脂加工、食品、医药等行业领域。自然界中，脂肪酶普遍存在于植物种子、动物组织及微生物中，其中，工业用脂肪酶多源于微生物。因其反应所需条件温和，催化率高，立体选择性好，广泛的底物特异性以及便于提取与潜在的无限供给，所以得到广大工业领域的普遍使用。

在当今社会，由于食品工业的迅猛发展，消费者的食品安全和健康意识日益增强，对面粉及豆制品的要求越来越高。若想生产好的面粉，就要有优质的原材料,所以需要在食品处理中添加催化酶，酶的催化效率特别高，比普通催化剂高出100倍以上，它不仅能提高面包的烘焙品质，还可以延长制品的保质期。

蛋白酶是可以水解蛋白中的肽键并生成氨基酸或小肽的一类酶，是世界三大酶制剂之一，占全球酶制剂销量的60％，其主要来源于动物、植物和微生物，一般情况下不含有毒有害物质，而且水解反应完全后自身可以被灭活，因此在食品工业中有着广泛的应用。其中酸性蛋白酶是一种适合于在酸性环境下水解蛋白质的酶类，它主要用于毛皮软化和脱毛处理，也可用于羊毛低温染色和啤酒澄清工艺，以及消炎止咳，化痰和助消化。在啤酒澄清过程中需要添加蛋白酶来降解啤酒中的悬浮物，以提高啤酒的澄清度，另外还可以提高底物的利用率，降低成本。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常可以通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料。由于淀粉酶的高效性以及专一性，酶退浆的退浆率高，污染少，且不损伤纤维。其中α-淀粉酶是目前运用最多的一种水解酶类之一，可用于食品工业、啤酒酿造、发酵、饲料、纺织、酒精工业、烘焙工业、医药等许多工业。

纯化蛋白的过程中由于各蛋白的特性不一，若想分离出一种目标蛋白，需考虑蛋白分子的带电性质，溶解度，分子大小以及配体特异性，通常会经过多步层析逐步消除杂蛋白特性的方法来纯化。现有技术中没有同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三种蛋白的方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同步纯化脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶三种蛋白的方法。通过一步层析法，并结合本发明的反应条件，可同步纯化出三种目标蛋白，其操作简便，仅需一次离子层析便可高效纯化三种蛋白，最终使得脂肪酶纯化倍数提高63.24倍，酸性蛋白酶10.33倍，α-淀粉酶31.69倍。

为实现上述目的，本发明采用硫酸铵盐析以及Q Beads 6FF阴离子层析来进行三种蛋白的纯化。该蛋白纯化技术通过下述步骤进行：

(1)通过硫酸铵盐析的方法确定三种蛋白析出时所对应的硫酸铵饱和度；

分别将三种酶粉与各自的缓冲液按照1:10(1g酶粉：10mL缓冲液)的比例进行稀释，混匀后8,000rpm离心5min，在上清液中加入硫酸铵粉末使硫酸铵饱和度达到40％，静置30min后，8,000rpm再次离心5min，在上清液中再次加入硫酸铵粉末使硫酸铵饱和度达到50％，静置30min，8,000rpm再次离心5min，上清液补充硫酸铵至60％饱和度，梯度盐析直至硫酸铵饱和度为90％，最后收集各梯度的上清和沉淀放入透析袋中除盐。

(2)将5-10倍柱体积盐析后的酶液上样于Q柱，流速为1-5mL/min，(上样前酶液需经0.45μm滤头过滤除杂。