[发明专利]一种乳铁蛋白含量的凝胶电泳检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种乳铁蛋白含量的凝胶电泳检测方法及试剂盒。该方法利用能够与乳铁蛋白结合的DNA作为探针分子，根据DNA‑乳铁蛋白结合物与未结合乳铁蛋白的DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，结合条带的灰度值，从而对乳铁蛋白含量进行检测。本发明无需样品预处理，适用于奶粉、生牛乳等中乳铁蛋白的直接检测，特异性强、灵敏度高。此外，该方法无需借助色谱/质谱/光谱等大型仪器，使用电泳仪即可对乳铁蛋白进行快速、低成本、高通量检测。

技术领域

本发明属于食品检测领域，涉及一种乳铁蛋白含量检测方法，特别涉及一种乳及乳制品中乳铁蛋白含量的琼脂糖凝胶电泳检测方法及试剂盒。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin,简称LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白，分子量为70～80kD，广泛存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌或中性粒细胞中。1961年，Blanche等从人乳中分离并命名为乳铁蛋白。许多其他哺乳动物分泌物中也含有乳铁蛋白。

乳铁蛋白具有增强机体抗菌、抗病毒能力，调节机体免疫，抗癌、抗氧化以及增加对铁的吸收，降低对有效铁的使用量，提高肠细胞对铁的生物可用性，降低铁摄入过多的影响等生物活性。在GB 14880-2012《食品营养强化使用标准》中将乳铁蛋白作为营养强化剂，在调制乳粉、婴幼儿配方食品等中添加量为≤1.0g/kg。因此，建立快速准确的乳铁蛋白检测技术至关重要。

目前，乳铁蛋白主要检测方法有高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、分光光度法、酶联免疫吸附法(ELISA法)等，但由于乳铁蛋白结构的特点、实际样品基质复杂和含量甚少等原因，造成样品前处理复杂、受样品中其他物质的干扰明显、检测成本高，及含量测定的检测限高、重现性和准确性较差等问题。

乳铁蛋白等电点为8.5～9.0，在中性条件下带正电荷，与带负电荷的肝素、脂多糖LPS以及DNA具有很强的亲和性(van Berkel,P.H.,et al.(1997)Biochem J 328:145-151)。利用这种亲和性，可以通过固定的肝素或者DNA对乳及乳制品中的乳铁蛋白进行分离纯化。例如，液相色谱法检测乳铁蛋白中，广泛采用肝素亲和柱对食品样品进行前处理。通过高通量筛选，已经获得了能够特异性结合乳铁蛋白的DNA序列(He,J.and P.Furmanski(1995)，Nature 373(6516):721-724；Britigan,B.E.,et al.(2001)，The Journal ofImmunology 167(5):2921-2928；Liu,X.H.,et al.(2017)，Lab on a Chip 17(1):178-185)。2017年许丹科等以荧光标记的DNA作为探针分子，通过其与乳铁蛋白的特异性结合使荧光偏振信号发生变化，实现了对牛奶中乳铁蛋白的测量(参见Liu,X.H.,et al.(2017)，Lab on a Chip 17(1):178-185；中国专利CN106645050A)，但该方法需要价格昂贵的酶标仪。

发明内容

本发明针对现有检测乳铁蛋白含量的方法存在的成本高和样品处理复杂等不足，提供一种准确度高、方便、快捷的乳铁蛋白含量的凝胶电泳检测方法及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种乳铁蛋白含量的凝胶电泳检测方法，该检测方法包括以下步骤：

采用能够结合乳铁蛋白的DNA作为探针分子，利用样品中通过探针分子结合形成的探针分子-乳铁蛋白复合物与未结合乳铁蛋白的探针分子在核酸凝胶电泳中的迁移率不同，得到与样品中的乳铁蛋白对应的电泳条带；根据不同浓度乳铁蛋白与探针分子结合所形成的复合物在电泳条带灰度值上的差异性，对样品中的乳铁蛋白进行定量。

优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：

1)DNA的前处理：将所述DNA进行变性和退火，得到具有一定构象的单链DNA；