[发明专利]一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法

说明书

本发明公开了一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，包括以下步骤：步骤1：Annexin V蛋白表达纯化：1.1：基因序列优化：查找人Annexin V蛋白的基因序列，将人Annexin V基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；1.2：Annexin V蛋白诱导表达：挑取重组质粒单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD₆₀₀为0.4‑0.6；在菌液中加入诱导剂诱导培养；本发明在设计Annexin V基因序列时保留蛋白两端的His标签，便于Annexin V蛋白和Annexin V‑APC偶联物纯化，只需常规的镍柱纯化，无需专门的纯化设备，纯化步骤少、时间短，降低了纯化成本，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。

技术领域

本发明涉及一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法。

背景技术

Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族，具有抗凝作用，分布广泛，在多种组织细胞(如心肌细胞、肝细胞、内皮细胞等)中表达。AnnexinV在染色体上位于人的第4条染色体4q26-q28上的AnnexinV基因编码，共320个氨基酸，包括70-80个氨基酸的重复单元，分子量约36kD。在细胞凋亡过程中，凋亡细胞膜发生变化，PS从细胞膜的脂双层内层迁移至外层是细胞凋亡级联反应的初始事件，AnnexinV蛋白与细胞膜上的PS有很高的亲和力，因此利用AnnexinV高亲和PS可早期检测凋亡的发生。

目前AnnexinV蛋白主要应用于细胞凋亡检测。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是由基因控制的细胞主动的有序性死亡，是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，与多种疾病病理密切相关。PCD的主要形式有凋亡、自噬和焦亡等，是不同于坏死和意外死亡的。作为细胞生命周期中重要的组成部分，在凋亡的过程中伴随着细胞形态的改变以及一系列基因的激活、表达及调控等作用。细胞发生凋亡最早期改变发生在细胞膜上，磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内层翻向外层，使PS暴露于细胞膜外表面，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、核内DNA片段化等凋亡现象。AnnexinV与PS有高度亲和力，故可与细胞凋亡早期暴露在细胞膜外侧的PS结合。Annexin V标记荧光素FITC、PE、APC等，利用流式细胞仪等检测细胞凋亡现象，可作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞检测的方法。

碘化丙啶(PI)和7-氨基放线菌素(7-AAD)是常用的核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期或死细胞，PI和7-AAD能够透过细胞膜给细胞核染色。因此将AnnexinV与PI或7-AAD结合使用，就可以将不同时期的细胞区分开。

APC与AnnexinV蛋白偶联后，偶联后的产物有AnnexinV-APC偶联物、游离的APC和AnnexinV。目前偶联后混合物纯化方法有分子筛高压液相色谱柱纯化、凝胶过滤层析、离子交换等。

分子筛高压液相色谱柱纯化，纯化纯度高，分辨效率高，但是由于只能少量纯化，不能量产，在生产上存在很大的局限性；

凝胶过滤层析，即分子筛，按照分子的大小分离蛋白子，由于AnnexinV分子量约36kD，APC分子量约104kD，Annexin V-APC偶联物约140kD，APC和AnnexinV-APC偶联物分子量差别很小，凝胶过滤层析不能很好的把两者分离开；

离子交换分离纯化蛋白，是建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上分离方法，由于Annexin V、APC和Annexin V-APC偶联物等电点很接近，所以不能用离子交换法分离纯化。

发明内容