[发明专利]一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法

权利要求书

1.一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：

1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；

1.2：AnnexinV蛋白诱导表达：挑取重组质粒单菌落，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浓度OD₆₀₀为0.4-0.6；在菌液中加入诱导剂诱导培养；

1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：收集的菌液经离心、缓冲液清洗后，加入超声裂解液重悬菌体，加入溶菌酶和PMSF，混匀后进行冰上孵育，再经超声破碎处理后，离心收集上清溶液进行纯化；

1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni琼脂糖层析柱纯化表达的AnnexinV蛋白，用平衡缓冲液平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白，透析袋对纯化的Annexin V蛋白进行透析过夜，收集透析后AnnexinV蛋白进行蛋白定量；

1.5：AnnexinV蛋白巯基化：将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶解于有机溶剂中配置SPDP母液，AnnexinV加入SPDP母液混匀反应获得Annexin V-SPDP溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子；脱盐后的AnnexinV-SPDP溶液中加入DTT，混匀反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；

步骤二：别藻蓝蛋白(APC)衍生化：将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶解于有机溶剂中配置SMCC母液，取APC溶液离心弃上清，加入缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对APC脱盐处理后加入SMCC母液混匀反应获得APC-SMCC溶液，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；

步骤三：APC-SMCC与AnnexinV-SPDP共价偶联：按照APC-SMCC与AnnexinV-SPDP混合后孵育，孵育结束后加入N-乙基马来酰胺(NEM)终止反应，得到偶联的AnnexinV-APC。

步骤四：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上述偶联的AnnexinV-APC，用平衡缓冲液平衡层析柱，将偶联的AnnexinV-APC总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，透析袋对具有活性的Annexin V-APC进行透析过夜，收集透析后偶联产物Annexin V-APC。

2.根据权利要求1所述一种别藻蓝蛋白(APC)与Annexin V蛋白偶联方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a，重组质粒单菌落为pET28a-Annexin V质粒单菌落。