[发明专利]一种利用新型dCas9调控基因表达的方法

说明书

CRISPRi系统由于可以阻断RNA聚合酶复合物的起始或延长来抑制基因转录，为了可控地调节基因的转录，dCas9基因会与各种诱导型启动子连接后进行表达。然而由于一些诱导型启动子宽松的调控机制，在不添加诱导剂的情况下，dCas9仍具有微弱的表达能力，进而对目的基因进行部分抑制。工业生产的大规模发酵中需要实现基因的精准调控，故诱导型启动子引起的泄露表达问题亟待解决。本发明的目的在于提供一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，利用密码子偏好性和tRNA氨酰化水平的差异，在翻译水平上，简单有效地通过补加氨基酸实现dCas9基因的表达调控。将dCas9基因中的氨基酸替换为其稀有密码子形式，外源添加对应氨基酸，可以使其恢复表达有功能的蛋白而发挥抑制作用。

技术领域：

本发明涉及一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

CRISPRi系统由于可以阻断RNA聚合酶复合物的起始或延长来抑制基因转录，因此被广泛的用于各种微生物以及细胞等。通常，为了可控地调节基因的转录，dCas9基因会与各种诱导型启动子连接后进行表达。然而由于一些诱导型启动子宽松的调控机制，在不添加诱导剂的情况下，dCas9依然具有微弱的表达能力，进而对目的基因进行部分抑制。工业生产的大规模发酵中需要实现基因的精准调控，故诱导型启动子引起的泄露表达问题亟待解决。

将dCas9基因中的氨基酸替换为其稀有密码子形式，外源添加对应氨基酸，可以使其恢复表达有功能的蛋白而发挥抑制作用。通过这种策略，可以在翻译水平上更加精确地调节基因的表达，减少基因泄露表达；诱导剂本身对细胞无毒害作用，价格低廉；稀有密码子对dCas9基因表达的调控只作用于含有此密码子的基因中，不会干扰到其他基因的表达和影响菌体的正常生长。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，利用密码子偏好性和tRNA 氨酰化水平的差异，在翻译水平上，简单有效地通过补加氨基酸实现dCas9基因的表达调控。

按照本发明提供的技术方案，一种利用新型dCas9系统调控基因表达的方法，采用以下方法步骤：

1.需要确定所用菌株和其密码子偏好性。

2.根据氨基酸密码子偏好性和dCas9基因序列，确定选用的氨基酸和其稀有密码子，将所需调控基因中的相应氨基酸的密码子替换为对应的稀有密码子，使用PCR方法重新人工合成此序列。

3.将步骤2中人工合成的基因序列与质粒载体1连接，将连接产物化转至感受态细胞中，经过PCR 验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒1。

4.设计靶向所需调控基因的sgRNA，利用PCR将sgRNA表达框连接到载体2上，将连接产物化转至感受态细胞中，经过PCR验证，挑选正确的单菌落，保存菌液，提取质粒2。

5.将3、4中提取的两质粒转化到同一感受态细胞中，涂平板，挑取单菌落接入培养基中培养，补加相应氨基酸，检测调控基因的表达。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业突进获取。

以下实施例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制。

实施例1、一种利用新型dCas9系统调控GFP表达的方法