[发明专利]一种间苯三酚的生产方法

说明书

间苯三酚作为高价值化合物前体物质，在医疗、材料等领域都有重要的应用前景。由于传统的化学合成方法在成本及环保等方面存在缺陷，本发明采用廉价且环保的乙酸作为碳源，实现间苯三酚的生物合成。本发明首先构建了两条以乙酸为碳源的合成途径，通过发酵验证了该方法的可行性，并确定了表达PhlD、AckA、Pta的途径为间苯三酚生产途径。分别优化M9发酵培养基中乙酸浓度和酵母提取物浓度，提高间苯三酚产量至228mg/L。利用绿色荧光蛋白eGFP证实了利用CRISPR/dCas9进行竞争途径抑制的可行性。随后进行发酵，通过CRISPRi将竞争途径中柠檬酸合酶的表达量降低，提高间苯三酚产量至284mg/L。本发明提出了一种新型的间苯三酚生产方法，该方法对间苯三酚的工业化生产提供了新策略。

技术领域

本发明涉及一种间苯三酚的生产方法，属于生物工程技术领域

背景技术：

酚类化合物及其衍生物具有良好的抗氧化活性，在生理及药理方面已有广泛研究。间苯三酚是一种三羟基酚类化合物，是重要的药物中间体，在抗病毒、抗肿瘤、抗炎、止血等多方面都具有良好的药理活性。在生物试剂方面，间苯三酚可被用作染料偶联剂、轮胎增粘剂及偶氮复合油墨等原料。同时，作为合成三氨基三硝基苯(TABA)这一耐热低感度炸药的前体，其在高含能材料、药物化学和材料科学领域也有重要的应用前景。

间苯三酚的化学合成存在原材料昂贵，分离纯化工艺复杂，副产物对环境污染严重等问题。目前，生物合成法已逐渐取代化学合成，是一种更经济、环保的合成方法。乙酸是第二种最简单的羧酸，许多微生物可以利用乙酸作为细胞生长的替代碳源。有研究表明醋酸盐可以通过生化过程从低成本的底物中产生。例如，一些有机废物在厌氧消化过程中会发酵产生醋酸盐。另外，醋酸盐也是木质纤维素生物质水解或热解的副产品，广泛存在于自然界中。与葡萄糖相比，醋酸盐是一种适合微生物发酵的成本效益碳源。因此，利用乙酸为碳源，实现间苯三酚的生产是一种具有良好前景和高价值的环境友好方法。

发明内容：

本发明构建了两条以乙酸为碳源的间苯三酚合成途径。通过过表达乙酰辅酶A合成酶(Acs或者AckA和Pta)催化乙酸生成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A再经过间苯三酚合酶(PhlD)催化生成间苯三酚。通过摇瓶发酵实验，首先确定了菌株BL21(DE3)(pET-phlD-ackA-pta)进行间苯三酚生产的可行性，随后进行发酵培养基中乙酸浓度及酵母提取物浓度的优化，将间苯三酚产量提高到228mg/L。为利用CRISPRi技术进一步提高间苯三酚产量，首先利用eGFP验证了CRISPR/dCas9的作用效果，然后进行摇瓶发酵，最终将产量提高到284mg/L。为间苯三酚的生物合成提供了新方法。

按照本发明提供的技术方案，一种间苯三酚的生产方法，采用以下方法步骤：

1.构建乙酸生产间苯三酚途径中所需质粒。寻找以乙酸为碳源生产间苯三酚的酶，利用PCR的方法人工合成相关基因(PhlD、AckA、Pta、Acs)。通过Gibson连接方法将目的基因克隆到pETDuet-1载体上，将连接产物转化至大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞中，长出单菌落后提质粒测序验证，构建质粒pET-phlD、pET-phlD-acs和pET-phlD-ackA-pta。

2.发酵确定间苯三酚生产途径。将1中构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，长出单菌落后接种于5mL液体LB培养基中过夜培养。随后将种子液以1％接种量接种到M9培养基中摇瓶培养。每隔12小时取样，利用HPLC检测产量，选择产量较高的途径作为间苯三酚的生产途径。

3.优化培养基中乙酸浓度。将2中最终确定的途径中的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，在M9培养基中发酵，优化培养基中的乙酸浓度(0g/L,2g/L,4g/L,6g/L,8g/L,10g/L)，利用HPLC检测最终产量以确定最适合生产间苯三酚的成分比例。

4.采用3中优化的乙酸浓度，继续优化M9培养基中的酵母提取物浓度(0g/L,1g/L,2g/L,3g/L,4g/L,5g/L)，提高间苯三酚产量。