[发明专利]一种间苯三酚的生产方法

权利要求书

1.一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，是通过在BL21(DE3)菌株中共表达间苯三酚合酶编码基因phlD,乙酸激酶编码基因ackA和磷酸乙酰转移酶编码基因ptA，并向培养基中添加乙酸作为碳源，优化M9发酵培养基中乙酸浓度与酵母提取物浓度，同时利用CRISPRi技术封闭竞争途径中GltA的表达以实现间苯三酚的生产及产量的提高；其特征在于采用如下步骤：

(1)根据不同途径中间苯三酚产量的差异从而确定以乙酸为碳源的间苯三酚生产途径；

(2)根据间苯三酚生产过程中M9发酵培养基配方，优化其中乙酸浓度与酵母提取物浓度；

(3)构建质粒pZE-pferB-egfp与pCS-dCas9-egfp-sgRNA，通过荧光检测验证CRISPR/dCas9封闭效果；

(4)构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA，将质粒pET-phlD-ackA-pta与pCS-dCas9-gltA-sgRNA共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，摇瓶发酵，通过dCas9对柠檬酸合酶表达的抑制从而提高间苯三酚产量；优化后的M9培养基组成为：11.28g/L 5×M9、2g/L乙酸、2g/LMOPS、5g/L酵母提取物。

2.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(1)中，通过比较过表达间苯三酚合酶和乙酰辅酶A合酶的重组菌株，以及过表达间苯三酚合酶、乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶的重组菌株在间苯三酚产量方面的差异，确定间苯三酚生产途径是在phlD、ackA和pta编码的间苯三酚合酶、乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶催化下完成。

3.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(3)中，通过Gibson方法将目的片段pferB-egfp连接到骨架pZE上，将目的片段egfp-sgRNA连接到骨架pCS-dCas9上，构建质粒pZE-pferB-egfp、pCS-dCas9-egfp-sgRNA，将两个质粒共转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃摇床培养后进行荧光检测。

4.如权利要求1所述的一种利用乙酸为碳源的间苯三酚生产方法，其特征在于步骤(4)中，通过CRISPR/dCas9抑制竞争途径中柠檬酸合酶的表达提高间苯三酚产量，利用Gibson连接的方法构建质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA后，将质粒pCS-dCas9-gltA-sgRNA与pET-phlD-ackA-pta共转到大肠杆菌BL21(DE3)中，种子液过夜培养后接种到优化后的M9培养基中，30℃摇瓶发酵，最终产量提高到284mg/L。