[发明专利]一种利用σ70

说明书

为最大化细胞工厂生产异丁醛的产量并使产率接近理论值，异丁醛合成途径必须能够持续高效地表达，以便最小化菌体生物量的增长及副产物的生成对资源的消耗。解除合成途径对σ⁷⁰的唯一性依赖，增强其对σ³⁸的兼容性是实现生产途径持续表达的关键。以σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达。

技术领域

本发明涉及一种抗胁迫启动子高产异丁醛的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

异丁醛工业上主要是加氢生产异丁醇，异丁醇是一种新型生物燃料，具有高能量密度、低吸湿性等优势；此外，异丁醛也用作氨基酸、维生素等药物的中间体；用于合成纤维素酯、香精、香料等；还可用于制造橡胶硫化促进剂和防老剂、异丁酸等。

为最大化细胞工厂生产异丁醛的产量并使产率接近理论值，异丁醛合成途径必须能够持续高效地表达，以便最小化菌体生物量的增长及副产物的生成对资源的消耗。理想状况下，菌体只进行一定程度的生长繁殖，在此期间合成异丁醛生产所需的前体物质及辅因子，当细胞数量达到生产需求时生长停止，合成途径开始高效表达。如果消除了生长对资源的竞争，途径酶可将前期累积的全部生产资源直接转化为目标化合物，此时细胞工厂的生产能力达到顶峰。然而，这一高产阶段通常难以维持。这是因为合成途径的表达一般依赖于看家型的σ⁷⁰因子，这类σ因子主导必需基因的转录，在对数生长期效用最强。当细胞进入稳定期后，胞内与胞外环境胁迫随之出现，此时胁迫响应σ³⁸因子大量生成，与σ⁷⁰竞争数量有限的RNAP 核心酶。且稳定期DNA超螺旋程度下降，谷氨酸盐类抗胁迫物质累积等胞内环境的变化也更有利于σ³⁸与核心酶的结合。因此，途径基因的转录通常与生长相偶联，一旦细胞生长停滞，合成途径的表达也随即下降，胞内资源开始大量分配给胁迫抵御等生存维持活动。因此，解除合成途径对σ⁷⁰的唯一性依赖，增强其对σ³⁸的兼容性是实现生产途径持续表达的关键。

以σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达。机理研究发现gadA启动子不受菌体生长期转变时胞内σ因子更替的影响，可被σ⁷⁰及σ³⁸型RNAP分别转录，表现出对低pH、谷氨酸盐累积、DNA超螺旋松弛等胁迫条件的抵御能力，能够在几乎整个细胞生长周期及胁迫条件下发挥转录活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种实现异丁醛稳定高产的方法，利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达，最终通过摇瓶发酵实验确定菌株最终的异丁醛产量，为实现异丁醛稳定高产提供新的方法。

按照本发明提供的技术方案，一种利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，采用

以下方法步骤：

1、以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区(–1至–183)的gadA启动子 P_gadA183

2、异丁醛合成途径由alsS-ilvC/D和kivd两个操纵子组成，分别在pSA69和pSA65两个质粒上，通过Gibson assembly将PgadA183插入至alsS-ilvC/D操纵子的RBS上游，替换原始启动子PLlacO1，得到质粒pMX1。

3、以类似2、3方法将pSA65质粒上的PLlacO1替换为PgadA183，得到质粒pMX2。