[发明专利]一种利用σ70

权利要求书

1.一种利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，以σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子gadA替代常规的σ⁷⁰型启动子驱动异丁醛的合成，解除合成途径对σ⁷⁰的唯一性依赖，增强其对σ³⁸的兼容性，实现了稳定期和酸胁迫条件下异丁醛合成途径的稳定表达；所述利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，采用如下步骤：A.以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，扩增包括上游完整非编码区–1至– 183的gadA启动子P_gadA183；B.使用PCR方法得到对应的基因序列，并将启动子与生产途径进行连接，构建新的重组质粒；C.将步骤B所得连接产物化转至大肠杆菌中，经过菌落PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到连接成功的重组质粒；D.制备用于发酵的菌株JCL260的感受态，将步骤C中得到的质粒使用化转至发酵菌株感受态中，涂布于平板上培养；E.将步骤D中转化得到的单菌落逐个转接至发酵培养基中，试管培养12小时；F.将步骤E所得种子液进行转接，进一步在发酵培养基中进行发酵培养，培养前在发酵瓶中加入同发酵液相同体积的油醇；发酵培养基组成为：6.0g/l Na₂HPO₄，3.0g/l KH₂PO₄，1.0g/l NH₄Cl，0.5g/l NaCl，1mM MgSO₄，0.1mM CaCl₂，10mg/l vitamin B1，8.5％葡萄糖，1％酵母提取物，调节pH至7.0，另加入100μg/ml氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素；

所述B步骤具体为：异丁醛合成途径由alsS-ilvC/D和kivd两个操纵子组成，分别装载于pSA69和pSA65两个质粒上，通过Gibson assembly将其插入至alsS-ilvC/D操纵子的RBS上游，替换原始启动子PLlacO1，得到质粒pMX1；以类似方法将pSA65质粒上的PLlacO1替换为PgadA183，得到质粒pMX2。

2.如权利要求1所述的一种利用σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子实现异丁醛稳定高产的方法，其特征在于步骤(F)中，构建的σ⁷⁰非依赖型抗胁迫启动子调控的细胞工厂的发酵有效期能一直持续到稳定期。