[发明专利]一种实现生物燃料稳定生产的方法

说明书

本发明提供一种利用σ⁵⁴启动子实现将生物废料稳定转化为生物燃料的方法。本发明所提供的方法是按照包括以下步骤进行：首先确定要生产的生物燃料的合成途径，以及选择要使用的σ⁵⁴依赖型启动子。通过PCR基因片段，人工组装构建出σ⁵⁴依赖型启动子调控的特定生物燃料生产途径，与发酵菌株(ΔglnAΔgdhA)组合，构建出能高效、持续、稳定生产的细胞工厂。本发明所提供的方法可以用于不同种类的生物燃料生产。相对于传统细胞工厂，其发酵过程的有效期能延长到稳定期，不需要外源添加各种诱导物，且抗胁迫能力显著增强，所利用的氮源可以从精制氮扩展到蛋白废料，具有相当的实用价值何发展前景。

技术领域

本发明涉及利用σ⁵⁴依赖型启动子实现将生物废料稳定转化为生物燃料的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物燃料作为一种由生物质转化而来，可以取代石油等不可再生资源的新兴燃料，是可再生能源开发利用的重要方向。在原料和产业上都具有相当的多样性，在储藏和运输方面也具有相当的便利性。最突出的优点在于其环保性，生物燃料的全部物质在使用过程中都能直接进入地球的生物质循环，真正实现零排放。

以其中一种重要的有机合成原料，异丁醇为例。一个理想的异丁醇微生物细胞工厂应该具有相当高的原料转化效率，同时做到持续表达相关的功能基因。然而，在实际生产中，产量和产率往往会远低于理论水平，主要原因有以下几点：第一，由于长期以来细胞进化形成的鲁棒性，传统细胞工厂使用的σ⁷⁰依赖型启动子的活性由于σ因子竞争，会在发酵进入稳定期后显著降低，直接影响下游酶基因的表达量，细胞工厂几乎停止运转。第二，工厂在生产目标产物的过程中会产生各种废物，这些废物的累积不仅会打破培养环境各种平衡，还会对细胞本身产生毒害作用，影响产量的提升。

本发明从与氮源供应量呈现负响应关系的σ⁵⁴依赖型启动子出发，该类启动子会在氮源不足(发酵后期)的条件下表现出更强的转录活性，同时还能抵抗发酵条件中的胁迫环境。利用它来解决传统细胞工厂面临的各类问题，实现异丁醇等生物燃料的稳定生产。

最终稿在实际的生产过程中，σ⁵⁴依赖型启动子glnAp2、argTp表现出相对于传统σ⁷⁰依赖型启动子rrnB等明显的优势，同时与目前用于异丁醇生产的活性最强的σ⁷⁰启动子P_LlacO₁产量持平，甚至在胁迫条件下产量相对于P_LlacO₁更高，如附图1所示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现将废料蛋白稳定转化为异丁醇等生物燃料的方法。使用能够响应环境中氮源有效性的σ⁵⁴启动子控制目的产物生产途径的表达。利用该类启动子抗胁迫条件，且表达活性与氮源供应量呈现负响应关系的特性，结合敲除氨同化基因glnA及gdhA的发酵菌株，成功构建出摆脱生产周期的影响，能持续工作到到发酵稳定期的细胞工厂。成功实现异丁醇等生物燃料的稳定生产。

按照本发明提供的技术方案，一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现异丁醇等生物燃料稳定生产的方法，采用以下方法步骤：

1.确定要使用的σ⁵⁴依赖型启动子，确定要使用的生物燃料的生产途径。

2.使用PCR方法得到对应的基因序列，并将启动子与生产途径所在进行连接构建新的重组质粒。

3.将步骤二所得连接产物化转至大肠杆菌中，经过菌落PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到连接成功的重组质粒。

4.制备用于发酵的菌株(ΔglnAΔgdhA)的感受态，将步骤3中得到的质粒使用电转至发酵菌株感受态中，涂布于平板上培养。