[发明专利]一种实现生物燃料稳定生产的方法

权利要求书

1.一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法，通过与氮源供应量呈现负响应关系的σ⁵⁴依赖型启动子，利用该类启动子不受细胞周期影响以及抗胁迫环境的特性，结合具体发酵菌株实现生物燃料的持续稳定生产；

所述利用σ⁵⁴依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法，采用如下步骤：A.根据要生产的生物燃料及其生产途径，确定要选用的σ⁵⁴依赖型启动子；B.使用PCR方法得到对应的基因序列，所述基因序列由基因alsS,ilvC,ilvD,avtA,leuDH,kivD,yqhD组成，并将启动子与生产途径进行连接，构建新的重组质粒；C.将步骤B所得连接产物化转至大肠杆菌中，经过菌落PCR验证，挑选正确的单菌落，提取得到连接成功的重组质粒；D.制备用于发酵的菌株的感受态，将步骤C中得到的质粒使用电转至发酵菌株感受态中，涂布于平板上培养；所述用于发酵的菌株敲除了基因组上的两个氨同化基因glnA，gdhA；E.将步骤D中转化得到的单菌落逐个转接至发酵培养基中，试管培养24小时；F.将步骤E所得种子液进行转接，进一步在发酵培养基中进行发酵培养； 发酵培养基组成为：40g/L酵母提取物，1mM MgSO4 ,0.1mMCaCl2 ,维生素B1,氨苄青霉素100μg ml^–1和硫酸卡那霉素50μg ml^–1；G.将步骤E所得的种子液进行转接，用经过碱处理，高温处理以及蛋白酶处理之后的废弃蛋白作为氮源进行发酵培养；

所述σ⁵⁴依赖型启动子为glnAp2或argTp。

2.如权利要求1所述的一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法，其特征在于步骤(F)中，构建的σ⁵⁴依赖型启动子调控的细胞工厂的发酵有效期能一直持续到稳定期，且不需外加诱导剂。

3.如权利要求1或2所述的一种利用σ⁵⁴依赖型启动子实现生物燃料稳定生产的方法，其特征在于步骤(G)中，构建成功的细胞工厂可以直接以处理后的废弃蛋白为氮源进行发酵。