[发明专利]大鼠骨髓源肥大细胞培养方法

说明书

本发明公开了大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：脱颈法处死出生3‑5周的SD青年大鼠，用75%酒精浸泡消毒3min，然后转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨；剪去股骨两端的股骨头，使用注射器吸取DMEM/F12基础培养基，将股骨骨髓吹打出来，吹打过程中将骨髓冲洗干净；使用巴氏吸管将骨髓吹打30次制成单细胞悬液，通过离心机进行离心，收集细胞，并弃掉上清液；再加入红细胞裂解液在4摄氏度下裂解3min。本发明通过肥大细胞诱导培养基、肥大细胞促成熟培养基进行培养和多次离心分离，使得培养出来的肥大细胞纯度较高，且培养周期大大缩短。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为大鼠骨髓源肥大细胞培养方法。

背景技术

肥大细胞广泛分布于皮肤及内脏粘膜下的微血管周围，分泌多种细胞因子，参与免疫调节，表达MHC分子，B7分子，具有APC功能，表达大量的IgE Fc 受体，释放过敏介质，具有弱吞噬功能，和血液的嗜碱粒细胞同样，具有强嗜碱性颗粒的组织细胞，过去对肥大细胞的研究多关注于其在超敏反应疾病中的作用，但自从2006年首次发现肥大细胞缺陷小鼠难以诱导皮肤移植耐受，输注骨髓源性MC重建MC正常鼠移植耐受得以诱导，证明了肥大细胞在器官移植耐受中的关键作用，但是现有的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法培养出来的肥大细胞纯度较低，且培养周期长，影响实验进度，因此有必要对现有技术进行改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，以解决上述背景技术中提出的现有的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法培养出来的肥大细胞纯度较低，且培养周期长，影响实验进度的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：

S1：脱颈法处死出生3-5周的SD青年大鼠，用75%酒精浸泡消毒3min，然后转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨；

S2：剪去股骨两端的股骨头，使用注射器吸取DMEM/F12基础培养基，将股骨骨髓吹打出来，吹打过程中将骨髓冲洗干净；

S3：使用巴氏吸管将骨髓吹打30次制成单细胞悬液，通过离心机进行离心，收集细胞，并弃掉上清液；

S4：再加入红细胞裂解液在4摄氏度下裂解3min，再通过离心机进行离心，收集细胞，并弃掉上清液，再吸取肥大细胞诱导培养基重悬细胞液，清洗除去残留红细胞裂解液；

S5：使用注射器吸取肥大细胞诱导培养基重悬细胞液，接种至T25瓶内培养，培养过程中每3天换液一次，换液至第8次时收集培养基中变圆脱落的细胞，即未成熟肥大细胞；

S6：将含有未成熟肥大细胞的培养基转移至离心管内，通过离心机进行离心操作，离心完成后收集细胞，然后使用注射器吸取肥大细胞促成熟培养基重悬细胞液，接种至T25瓶内培养，培养过程中每3天换液一次，换液培养5次后可得到分化成熟的肥大细胞。

优选的，所述S1中脱颈法的具体操作方法设置为：左手用镊子夹住大鼠的颈部，右手抓住大鼠尾巴，两手同时用力牵拉，将大鼠颈椎拉断即可。

优选的，所述S3和S4中离心机的转速均设置为1000rmp，离心时间均设置为5min。

优选的，所述S4和S5中肥大细胞诱导培养基的配制方法设置为：超净工作台内取一定量的DMEM/F12基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入FBS、50U/ml青霉素、100U/ml裂霉素、0.07%β-巯基乙醇、20ng/ml CSF、30ng/ml IL-3，通过过滤器过滤后转移至新的瓶内，4摄氏度冰箱保存备用。