[发明专利]大鼠骨髓源肥大细胞培养方法

权利要求书

1.大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

S1：脱颈法处死出生3-5周的SD青年大鼠，用75%酒精浸泡消毒3min，然后转入超净工作台内操作，剪开后肢皮肤，去除腿部肌肉，暴露出股骨，将股骨外部肌肉剥离干净，剪下股骨；

S2：剪去股骨两端的股骨头，使用注射器吸取DMEM/F12基础培养基，将股骨骨髓吹打出来，吹打过程中将骨髓冲洗干净；

S3：使用巴氏吸管将骨髓吹打30次制成单细胞悬液，通过离心机进行离心，收集细胞，并弃掉上清液；

S4：再加入红细胞裂解液在4摄氏度下裂解3min，再通过离心机进行离心，收集细胞，并弃掉上清液，再吸取肥大细胞诱导培养基重悬细胞液，清洗除去残留红细胞裂解液；

S5：使用注射器吸取肥大细胞诱导培养基重悬细胞液，接种至T25瓶内培养，培养过程中每3天换液一次，换液至第8次时收集培养基中变圆脱落的细胞，即未成熟肥大细胞；

S6：将含有未成熟肥大细胞的培养基转移至离心管内，通过离心机进行离心操作，离心完成后收集细胞，然后使用注射器吸取肥大细胞促成熟培养基重悬细胞液，接种至T25瓶内培养，培养过程中每3天换液一次，换液培养5次后可得到分化成熟的肥大细胞。

2.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述S1中脱颈法的具体操作方法设置为：左手用镊子夹住大鼠的颈部，右手抓住大鼠尾巴，两手同时用力牵拉，将大鼠颈椎拉断即可。

3.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述S3和S4中离心机的转速均设置为1000rmp，离心时间均设置为5min。

4.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述S4和S5中肥大细胞诱导培养基的配制方法设置为：超净工作台内取一定量的DMEM/F12基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入FBS、50U/ml青霉素、100U/ml裂霉素、0.07%β-巯基乙醇、20ng/ml CSF、30ng/ml IL-3，通过过滤器过滤后转移至新的瓶内，4摄氏度冰箱保存备用。

5.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述S6中肥大细胞促成熟培养基的配制方法设置为：超净工作台内取一定量的1640基础培养基于无菌、干净的瓶内，加入FBS、1ml双抗、0.07%β-巯基乙醇、30ng/ml CSF、50ng/ml IL-3，通过过滤器过滤后转移至新的瓶内，4摄氏度冰箱保存备用。

6.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源肥大细胞培养方法，其特征在于：所述S6中离心机的转速设置为1200rmp，离心时间设置为5min。