[发明专利]一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用，属于生物技术领域。本发明利用细菌人工染色体克隆载体构建一个包括含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段、AnpeNPV多角体蛋白基因启动子序列和上游基因部分序列DNA片段、及多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列DNA片段的转移载体，将线性化转移载体质粒DNA与线性化的AnpeNPV基因组DNA共转染Tn‑High Five细胞，得到重组AnpeNPV。将该重组AnpeNPV基因组DNA转化至大肠杆菌中，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV‑bacmid。它既可以在大肠杆菌中以质粒DNA方式复制，亦可在Tn‑High Five昆虫细胞以及柞蚕蛹体内以病毒DNA方式复制，具有感染性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用。

背景技术

杆状病毒(Baculoviruses)亦称为核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPVs)，是一种可在昆虫细胞核中形成包涵体的昆虫病毒。目前已报道能够感染各种不同种类昆虫的杆状病毒超过了1000种，其中大多数感染的是鳞翅目昆虫。杆状病毒在害虫防控、病毒表达载体系统(The Baculovirus Expression Vector System,BEVS)建立和应用、病毒基因功能分析、病毒-昆虫宿主的相互作用等方面已成为重要的研究工具。

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanucleopolyhedrovirus，AcNPV)于1983年最先被用于建立杆状病毒表达载体系统。1993年，Luckow等人[Luckow et al.Journal of Virology,1993,67:4566-4579]将细菌F质粒DNA的复制子(mini-F replicon)整合到野生型AcNPV基因组中，构建了第一个杆状病毒穿梭载体(baculovirus shuttle vector,Bacmid)。在构建过程中，含有mini-F复制子、卡那霉素抗性标记基因(Kan^r)、细菌转座子Tn7转座靶点(mini-attTn7)及lacZα报告基因的DNA片段被克隆构建成一个AcNPV转移载体pMON14272；将pMON14272质粒DNA与野生型AcNPV基因组DNA共转染昆虫细胞Sf9，利用DNA同源重组原理(homologous recombination)，将mini-F复制子等上述元件插入到AcNPV基因组多角体蛋白基因(polyhedrin,polh)位点处，产生含有mini-F复制子等上述元件的重组AcNPV；重组AcNPV通过病毒噬斑筛选得到分离，再经过病毒扩繁，提取重组AcNPV基因组DNA；将重组AcNPV基因组DNA转化至大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆，完成AcNPV-Bacmid构建。AcNPV-Bacmid基因组中包含AcNPV基因组DNA、细菌质粒mini-F复制子、卡那霉素抗性标记基因(Kan^r)、细菌转座子Tn7转座靶点(mini-attTn7)及lacZα报告基因。AcNPV-Bacmid既能在细菌中以质粒DNA的方式复制，又能在昆虫细胞Sf9(Sf21或Tn-High Five)中以杆状病毒DNA的方式复制。利用AcNPV-Bacmid构建重组AcNPV的过程是在细菌中完成的：将克隆有目的基因的、并具有Tn7转座臂(the left and rightarms of Tn7)的转移表达载体质粒DNA转化至含有AcNPV-Bacmid和表达转座酶的辅助质粒的宿主菌中，目的基因的表达框在转座酶的作用下，通过转座重组(the site-specifictransposition)方式插入到AcNPV-Bacmid基因组mini-attTn7位点中，获得重组的AcNPV-Bacmid；提取重组AcNPV-Bacmid DNA直接用于转染昆虫细胞，即可获得重组AcNPV。这一方法省去了早期研究方法中需要在昆虫细胞中进行基因同源重组、经多轮病毒噬斑筛选获得重组病毒的过程，简化了实验流程，产生重组病毒的效率由早期的0.1～1％提高至近100％，获得重组病毒的周期由过去的4～6周缩短至7-10天。Invitrogen公司据此项技术为基础开发的AcNPV Bac-to-Bac表达系统不仅在重组蛋白表达、疫苗制备等研究和开发方面得到广泛应用，也为AcNPV基因组进行基因敲除、开展基因功能的深入研究提供了重要的研究工具。