[发明专利]一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用

权利要求书

1.一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以克隆载体pSMART BAC质粒DNA为模板，用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增，得到片段1，长度为923bp；以克隆载体pSMART BAC质粒DNA为模板，用引物SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，得到片段2，长度为6699bp；琼脂糖凝胶电泳回收片段1和片段2，将片段1和片段2混合后作为模板，用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4进行PCR扩增，得到长度为7.5kb的DNA片段，即得具有BamH I、Avr II(Bln I)、Hind III和EcoR I单一克隆位点的衍生克隆载体pSMARTBAC-N1；

（2）将含有lacZα报告基因和细菌转座子Tn7转座靶点序列的DNA片段lacZα:mini-attTn7:lacZα克隆至载体pSMARTBAC-N1的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点上，构建得到中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα；所述lacZα:mini-attTn7:lacZα的具体构建方法为：以AcNPV穿梭载体DNA为模板，用引物SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6进行PCR扩增，得到400bp片段；将上述片段克隆到pMD18-T载体上得到质粒，并经测序确认后，用限制性内切酶Bgl II和Avr II(Bln I)双酶解质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收400bp DNA片段，即得；

（3）将含有AnpeNPV多角体蛋白基因polh启动子序列和上游基因部分序列的DNA片段、及含有多角体蛋白基因3’末端部分编码区序列和下游基因部分序列的DNA片段依次克隆至中间载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的相应克隆位点处，构建转移载体pSMART BAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN；具体方法为：

（a）以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增，得到长度为1286bp的DNA片段；

（b）以AnpeNPV基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10进行PCR扩增，得到长度为1139bp的DNA片段；

（c）将步骤（a）得到的片段先克隆至中间载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα的Avr II(Bln I)和Hind III克隆位点处，得到阳性克隆载体，再将步骤（b）得到的片段克隆至上述阳性克隆载体的BamH I和Avr II(Bln I)克隆位点处，即得转移载体pSMARTBAC-N1/lacZα:mini-attTn7:lacZα/phΔN；

（4）将步骤（3）制得的转移载体质粒DNA线性化，与线性化的AnpeNPV基因组DNA共转染Tn-High Five细胞，得到重组AnpeNPV；所述线性化的AnpeNPV基因组DNA为利用Avr II(BlnI) 酶解ApNPV-Δph/Avr II⁺/egfp⁺基因组DNA得到；

（5）将步骤（4）所得重组AnpeNPV的基因组DNA进行分离制备，并转化至大肠杆菌中，在含有氯霉素、X-Gal和IPTG的细菌培养板上进行蓝、白菌落筛选，挑取蓝色菌落进行液体培养，获得AnpeNPV穿梭载体AnpeNPV-bacmid。