[发明专利]一种丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法

说明书

本发明涉及一种丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法，将丝素蛋白海绵的制备工艺大幅简化，同传统方法需要使用有机溶剂和各种交联剂进行化学交联相比，本方案通过无毒性添加成分，制备多孔海绵结构的设施要求低，仅需要低温恒温箱一个设备，交联时间同目前已有的方案相比大幅缩减，整个实施方案从时间和经济上都实现了工艺上的显著提升。本技术方案从丝素蛋白溶液的制备到最终获得多孔海绵，即通过差式热实验寻找玻璃化转变温度—低温冷冻保存—解冻，实现丝素蛋白无添加剂的低温冷冻海绵制备。

技术领域

本发明属于医用组织修复技术领域，特别是指一种绿色无添加剂的丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法。

背景技术

丝素蛋白是由节肢动物(桑蚕、蜘蛛、蜜蜂、蝎子等)腺体所分泌的丝中提炼而来。和其他用作生物材料的蛋白相比，蚕丝有许多优势。生物源蛋白多从同种异体或异种动物中提取，因此有较高的感染风险，丝素蛋白通过提炼，可以最大程度避免感染和免疫原性的问题。此外蛋白的提取分离和提纯所需的操作价格非常昂贵。相比之下丝素蛋白的获得来源简单易行，提纯方式也更为廉价，仅通过碱热的方式脱去蚕丝中的丝胶蛋白即可。

丝素蛋白的分子量较大(200～350kDa)，且拥有较多的疏水分子链段。丝素蛋白根据获得蚕的种类不同分为桑蚕类和非桑蚕类。前者结构上由一个重链(H)和一个轻链(L)通过二硫键交联在一起。在H链的疏水段有一类Gly-X(X包括Ala、Ser、Thr和Val)重复单元，这一结构有助于重链形成反向平行的β折叠。L链亲水性更好，并且具有一定的弹性。除此之外还有一种25kDa的糖蛋白，P25，也通过非共价键的形式参与到稳定链段的过程中。非桑蚕类的丝素蛋白并没有L链和P25分子，这类丝素蛋白由H链的二聚体组成，通过H链中较高的Ala/Gly比例和聚丙氨酸区域来实现β折叠。两种丝素蛋白由于结构的不同，其力学、生物活性以及降解性也有明显的区别。当丝素蛋白溶解在水中时，其中的亲水链段会形成无规链段，使得蚕丝具有弹性。而当丝素蛋白形成二级结构时，亲水链段会组成链段中的无定形的自由结构。

诱导丝素蛋白进行交联的主要方法是增加链段的运动，降低分子间的电荷排斥，提高分子间形成二级结构的概率。常见的手段包括超声处理、电场刺激、添加金属离子、加入酸调整pH至4.1(丝素蛋白等电点)。丝素蛋白的氨基酸组成中包含5％的酪氨酸，因此也可以利用过氧化氢酶和过氧化氢对其进行酶交联反应，形成强度较弱的透明水凝胶。尽管目前已经拥有多种诱导丝素蛋白进行交联的方法，但是这些方法操作复杂，需要对pH、离子浓度、电场、有机溶剂等多方面进行调控，提高了丝素蛋白向临床转化的难度。

目前已有许多方案利用低温温度调控的方式实现丝素蛋白海绵的制备。Ak在《Macroporous silk fibroin cryogels》一文中，通过添加交联剂乙二醇二缩水甘油醚和催化剂四甲基乙二胺，通过冷冻后再解冻，形成高回弹性水凝胶。Tamada在《New processto form a silk fibroin porous 3-D structure》一文中利用有机溶剂和水混合作为溶剂，在-20℃下冷冻12小时，解冻后获得多孔泡沫结构。刘海峰等人在公开号为CN105749343A的中国发明专利《一种无需有机溶剂且二级结构可控的丝素蛋白多孔材料的制备方法》中，利用温度控制实现了丝素蛋白海绵的制备。

除上述方案外，目前最为常见的丝素蛋白海绵制备方是通过利用甲醇和乙醇对蛋白进行诱导变性，形成以β折叠为主的二级蛋白结构。在《Novel silk fibroin/elastinwound dressings》一文中，Andreia等人通过将弹性蛋白与丝素蛋白共混冻干并用90％甲醇溶液浸泡，实现皮肤敷料的制备。