[发明专利]增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法

说明书

本发明公开了一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法，涉及生物技术领域。本发明公开的增强剂具有结合荧光染料的结构域和淬灭基团，淬灭基团用于淬灭结构域所结合的荧光染料所发射的荧光。由于上述结构域与荧光染料结合的亲和力低于核酸扩增反应的目标扩增产物与荧光染料结合的亲和力，该增强剂不仅能减小高浓度的荧光染料对扩增反应的抑制；还能增强基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为扩增指示剂在微流控芯片上应用的可靠性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法。

背景技术

链式聚合酶反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种应用广泛的分子生物学技术。该技术可以对特定的核酸片段进行指数型扩增。为了实时监控PCR反应，可以通过熔解曲线分析方法(high resolution melting analysis，HRM)来鉴定PCR产物，或在PCR反应液中加入荧光指示剂。用于PCR反应的荧光指示剂主要分为两大类：一类是荧光探针，如Taqman探针，分子信标探针；另一类是能与双链DNA结合的荧光染料，如EtBr，SYBRGreen I(SGI)，EvaGreen，Sytox Green。虽然荧光探针能够与PCR产物特异性结合，并用于多重PCR反应中，但荧光探针的合成费用通常较贵。此外，荧光探针应用于不同的目标核酸序列时，需要进行复杂的设计并对反应条件进行优化。

而另一方面，核酸染料价格低廉，与双链DNA的非特异性结合使得其可以不受限的应用于任何双链核酸序列。当核酸染料与双链DNA结合时，其荧光强度可以增强至1000倍，灵敏度极高。然而，此类核酸染料在较高浓度下会抑制扩增反应，使得其应用被局限于低浓度范围内。因此，高浓度核酸染料对扩增反应的抑制限制了其在PCR以及相关技术中的应用。

双链DNA荧光染料的另一缺陷是其与微流控系统的不相容。近年来，由于微流控系统低试剂损耗、反应快速、设备尺寸微型等诸多优势，在微流控芯片上进行PCR反应(on-chip PCR)已成为一个研究热点。然而，我们观察到在某些微流控系统中，SGI这种核酸染料会产生假阴性PCR结果。即便琼脂糖电泳已鉴定出扩增产物，证实扩增成功，SGI也没有给出阳性扩增信号。这种现象可能是由于染料分子扩散到周围的油环境中，也有可能是染料分子被芯片表面吸附所导致。Kong等研究人员(Kong,J.E.,Wei,Q.,Tseng,D.,Zhang,J.,Pan,E.,Lewinski,M.,Garner,O.B.,Ozcan,A.and Di Carlo,D.(2017)Highly Stable andSensitive Nucleic Acid Amplification and Cell-Phone-Based Readout.ACS nano,11,2934-2943.)在其开发的用于环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)的微流控芯片上也遇到了荧光染料可靠性和灵敏度降低的问题。对此，他们的解决办法是在反应液中加入羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)，然而HNB的效用依赖于离子浓度，而且只能通过有限地改变HNB浓度来调节其增强PCR的功能。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强核酸扩增反应的增强剂、试剂盒和进行核酸扩增反应的方法。本发明所提供的增强核酸扩增反应的增强剂不仅能减小高浓度的荧光染料对扩增反应的抑制；还能增强基于微流控芯片的核酸扩增反应中荧光染料的信号强度，提高荧光染料作为核酸扩增反应指示剂在微流控芯片上应用的可靠性，避免假阴性结果。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种增强核酸扩增反应的增强剂，其适用于含有荧光染料的核酸扩增反应，所述荧光染料能与所述核酸扩增反应的双链扩增产物结合；