[发明专利]一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，包括工作电极，参比电极和对电极，其特征在于，所述工作电极为玻碳电极其表面依次修饰钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)/金纳米粒子的复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂片电极；制备方法包括以下步骤：

(1)制备钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)复合材料，即M-NTO-PEDOT复合材料；

(2)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作电极；

(3)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作曲线；

所述步骤(1)具体包括以下步骤：

①制备钛酸盐

将1g LiF,加入20mL浓度为9mol L^-1的盐酸中，待LiF溶解后，将1g Ti₃AlC₂慢慢加入溶液中，在40℃下磁力搅拌24小时，离心，去上清液，用去离子水洗涤至中性，60℃下真空干燥6小时，得到Ti₃C₂粉末；将100mg的Ti₃C₂粉末，30mL浓度为1mol L^-1的氢氧化钠溶液和0.68mL质量分数为30％的过氧化氢溶液混合，然后将混合悬浮液在140℃下加热12小时，洗涤并烘干，得到钛酸盐，即M-NTO；

②制备钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)复合材料

称取90mg上述钛酸盐溶于10mL的水中，同时取200mg的3,4-乙撑二氧噻吩溶于2mL的乙醇中，混合上述溶液磁力搅拌5分钟；配置4mL浓度为1mol L^-1的FeCl₃·6H₂0溶液,慢慢滴加入上述混合悬浮液中,在磁力搅拌条件下，常温反应24小时，反应完毕后离心，去上清，乙醇洗涤后离心，去上清，将沉淀在真空干燥箱中60℃干燥，得到钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)复合材料，即M-NTO-PEDOT复合材料；

将5.0μL、1mg/mL上述M-NTO-PEDOT复合材料分散液滴加到电极表面上，在红外线烘箱中37℃烘干，作为工作电极；使用电化学工作站以三电极体系沉积金纳米粒子，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，在5.0mL、5mmol L-1的氯金酸溶液中，用时间-电流方法进行沉积，输入电压为-0.2V，运行时间为120s，得到钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)/金纳米粒子的复合材料即M-NTO-PEDOT-AuNPs复合材料修饰的工作电极。

2.根据权利要求1所述的一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括以下步骤：

①将直径为3.0mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，分别依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗；将5.0μL、1mg/mL上述M-NTO-PEDOT复合材料分散液滴加到电极表面上，在红外线烘箱中37℃烘干，作为工作电极；使用电化学工作站以三电极体系沉积金纳米粒子，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，在5.0mL、5mmol L^-1的氯金酸溶液中，用时间-电流方法进行沉积，输入电压为-0.2V，运行时间为120s，得到钛酸盐-聚(3,4-乙撑二氧噻吩)/金纳米粒子的复合材料即M-NTO-PEDOT-AuNPs复合材料修饰的工作电极；

②继续将5.0μL、100μg/mL的前列腺特异性抗体滴加到上述电极表面，在37℃水浴槽中孵育1.5小时；然后将5.0μL、0.1wt％的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，在37℃水浴槽中固定0.5小时，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，自然晾干，得到非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作电极。

3.根据权利要求1所述的一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：

将一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液滴加在所述步骤(2)制备的工作电极表面，在37℃水浴槽中孵育2小时，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，自然晾干，使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，在含有0.1M KCl和5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-且pH为7.0的磷酸缓冲液中，用差分脉冲阳极伏安法测固定抗原前后的工作电极的响应电流，得到二者电流差ΔI与初始电流I₀的关系，既抑制率，为ΔI/I₀，记录不同浓度下的抑制率与抗原浓度C_PSA，得到工作曲线，利用工作曲线法，得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。