[发明专利]一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法

说明书

本发明公开了一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，包括以下步骤：首先通过组合酶解液酶解银杏叶，得到银杏的原生质体；然后对得到的银杏原生质体进行分离、纯化，并且进行预处理，再利用PEG介导法将携带绿色荧光蛋白eGFP标签的p2FGW7.0质粒载体转入银杏原生质体中，经过培养，使其在银杏原生质体中表达。本发明构建得到银杏叶原生质体瞬时表达系统，操作简单易行，可以获得大量、完整、纯净的银杏叶原生质体，不受季节和地点的限制。本发明适用于银杏实生苗，利用幼嫩的叶即可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达90％，同时对于野外的成熟叶组织在一定程度上也适用。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法。

背景技术

银杏(Ginkgo bilobaL.)是银杏科(Ginkgoaceae)、银杏属(Ginkgo)的单属种植物，雌雄异株。银杏中生代孑遗的稀有树种，系我国特产，被称为植物活化石。在我国，银杏的栽培历史悠久，栽培范围广，北自东北沈阳，南达广州，东起华东海拔40-1000米地带，西南至贵州、云南西部(腾冲)海拔2000米以下地带均有栽培。银杏集食用、药用、材用、保健和生态功能于一体，具有很高的经济、生态、社会和人文价值。

原生质体是细胞进行新陈代谢活动的场所，植物原生质体由于没有细胞壁，更易摄取外源遗传物质，是进行细胞工程遗传操作和植物育种的良好材料。目前，越来越多的科研工作者利用原生质体进行细胞融合、亚细胞定位、蛋白质相互作用以及基因沉默与表达等研究。利用原生质体进行瞬时表达具有检测快、通量高的特点，结合荧光报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测、蛋白质相互作用等基因功能分析研究。

随着银杏基因组测序的完成，银杏古老而神秘的遗传密码也逐步拉开了面纱，大量的生物信息学分析也得以开展。银杏单科单属单种的特性，导致没有近源物种能为其提供研究平台，同时，银杏作为裸子植物本身遗传背景就较为复杂，其组培体系建立起来比较困难。种种原因导致银杏缺乏稳定的基因功能验证的研究平台，其相关遗传转化研究也进展缓慢。银杏在生物进化中的地位以及在药用方面的巨大价值，吸引着科研工作者对于银杏的深入研究，因此开发银杏的原生质体提取和瞬时表达体系，对在银杏中进行遗传转化和蛋白质互作的深入研究有着重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种银杏叶原生质体分离纯化及瞬时转化的方法，为银杏的基因功能验证、蛋白质互作研究提供快速便捷的研究平台。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，首先通过组合酶解液酶解银杏叶，得到银杏的原生质体；然后对得到的银杏原生质体进行分离、纯化，并且进行预处理，再利用PEG介导法将携带绿色荧光蛋白eGFP标签的质粒载体转入银杏原生质体中，经过培养，使其在银杏原生质体中表达。

组合酶解液中含有1-2％vol纤维素酶和0.1-0.3％vol果胶酶。

银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，包括如下步骤：

1)取2周银杏实生苗幼嫩叶，垂直于叶脉切成细条状备用；

2)5mL组合酶解液体系的配制：先于离心管中加入0.6M甘露醇、20mM MES、50mMKCl，70℃水浴3-5分钟；再加入组合酶，10mM CaCl₂和0.1wt％BSA，55℃水浴10分钟；最后0.45μm滤膜过滤灭菌，得到酶解液；

3)将步骤1)的细条状叶放入步骤2)制得的酶解液中充分浸润，于28℃黑暗环境静置酶解4-6h；