[发明专利]一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法

权利要求书

1.一种银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，首先通过组合酶解液酶解银杏叶，得到银杏的原生质体；然后对得到的银杏原生质体进行分离、纯化，并且进行预处理，再利用PEG介导法将携带绿色荧光蛋白eGFP标签的质粒载体转入银杏原生质体中，经过培养，使其在银杏原生质体中表达。

2.根据权利要求1所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，所述组合酶解液中含有1-2％vol纤维素酶和0.1-0.3％vol果胶酶。

3.根据权利要求1或2所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取2周银杏实生苗幼嫩叶，垂直于叶脉切成细条状备用；

2)5mL组合酶解液体系的配制：先于离心管中加入0.6M甘露醇、20mMMES、50mM KCl，70℃水浴3-5分钟；再加入组合酶，10mM CaCl₂和0.1wt％BSA，55℃水浴10分钟；最后0.45μm滤膜过滤灭菌，得到酶解液；

3)将步骤1)的细条状叶放入步骤2)制得的酶解液中充分浸润，于28℃黑暗环境静置酶解4-6h；

4)在步骤3)的反应液中加入与酶解液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心3-5min，吸出上清，再加入1-2mL W5溶液，轻柔摇匀后用血球计数板计数；圆底管置于冰上黑暗静置30min，使原生质体沉于管底，吸除上清，加入MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成10⁴-10⁶个/mL，并重悬；

5)在EP管中加入10-20μg质粒，100μL步骤4)获得的银杏原生质体悬混液，110μL 20-45wt％PEG溶液；轻柔混匀，室温孵育15-45min；加入1mL W5溶液，混匀后于1000rpm水平离心5min，吸出上清；并加入100μL WI溶液，并于25℃暗培16-20h。

4.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤2)中，组合酶为：2％vol纤维素酶，0.125％vol果胶酶。

5.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤3)中，酶解6h。

6.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤4)中，W5溶液的配方为：2mM pH为5.7的MES，154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，溶剂为水。

7.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤4)中，WI溶液的配方为：4mM pH为5.7的MES，0.6M甘露醇、20mM KCl溶液，溶剂为水。

8.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤4)中，MMG溶液的配方为：4mM pH为5.7的MES，0.5M甘露醇，15mM MgCl₂溶液，溶剂为水。

9.根据权利要求3所述的银杏叶原生质体分离纯化以及瞬时转化的方法，其特征在于，步骤5)中，在100μL浓度为10⁵个/mL的原生质体中，加入110μL40wt％PEG溶液、10μg质粒孵化30分钟，使用1mL W5终止反应，在100μL的WI溶液中暗培16-20h。