[发明专利]一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用

说明书

本发明涉及一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，制备步骤如下：⑴分析柱状黄杆菌的保护性抗原基因lip的成熟肽段序列；⑵穿梭质粒的构建；⑶重组菌株的筛选；⑷重组菌株的培养；⑸制备成口服疫苗。本发明疫苗是一种口服疫苗，通过口服免疫的方式接种，比注射免疫和浸泡免疫疫苗使用方便，更节省劳动力，并具有不受鱼体大小限制的优点。

技术领域

本发明属于分子生物学和水产技术领域，涉及水产动物免疫学，尤其是一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用。

背景技术

柱状黄杆菌是一种世界范围的水生动物致病菌，为革兰氏阴性杆菌。其宿主范围极为广泛，可感染包括鲤科、鲈科、鲶科、鲑科、太阳科、鲻科等多个科的鱼类，几乎所有的淡水鱼都对其敏感。在我国，柱状黄杆菌主要危害草鱼、鳜鱼、斑点叉尾鮰、泥鳅、金鱼等鱼类，其引起的柱形病为淡水鱼类发病率最高的细菌性疾病，给我国水产养殖业造成了严重的危害。

目前，主要通过使用抗生素和消毒剂等化学药物对柱形病进行防治，进行有一定的效果，但随着抗生素的长期使用和乱用所引发的问题已逐渐引进人们的重视。在挪威、美国、日本等水产发达国家，化学药物在水产养殖业中已逐渐被限用或禁用，开发新的防治方法迫在眉睫。其它防治途径相比，利用疫苗进行免疫防治的方法具有针对性强、效果显著、无毒无害、抗病周期长等不可替代的优势，符合高效、绿色、环保理念而日益受到人们的重视。

关于柱状黄杆菌疫苗的研究，现有技术目前主要有三方面的报道：

(1)柱状黄杆菌灭活疫苗

将柱状黄杆菌菌株接种于shieh培养基中，25℃培养摇床培养至平台期后，离心收集细菌，用生理盐水稀释到一定浓度。在菌液中加入终浓度为2％的苯酚或者0.5％的福尔马林25℃灭活24h，即为柱状黄杆菌灭活疫苗。

(2)柱状黄杆菌减毒活疫苗

将柱状黄杆菌在含利福平的shieh培养基中反复传代，经过243次传代后，培养基中利福平的含量从5μg/mL逐渐上升至200μg/mL，柱状黄杆菌对利福平产生耐药性，柱状黄杆菌的致病性逐渐减弱，培养毒性减弱的柱状黄杆菌，用生理盐水调整细菌浓度，即为柱状黄杆菌减毒活疫苗。

(3)柱状黄杆菌重组亚单位疫苗

通过将柱状黄杆菌的保护性抗原基因进行PCR扩增，与表达载体进行连接后，转入大肠杆菌表达菌株DE3，利用IPTG对重组菌株进行诱导，收集诱导后的细菌进行超声破碎，对重组蛋白进行收集和纯化，稀释至一定浓度后，即为柱状黄杆菌重组亚单位疫苗。

柱状黄杆菌灭活疫苗成分复杂，稳定性不强且在灭活过程中会导致部分蛋白免疫原性丧失而影响其免疫效果。柱状黄杆菌减毒活疫苗有回复突变的危险，存在安全隐患。柱状黄杆菌重组亚单位疫苗的制备比较繁琐，且需要注射免疫，在实际操作过程中存在困难。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法(CN103495159A)，其步骤包括：(1)表达载体的构建；(2)目的蛋白的表达和纯化；(3)将纯化好的蛋白进行浓度调整，得到可直接使用的柱状黄杆菌基因重组亚单位疫苗。本发明所制备的疫苗具有安全性高、免疫效果稳定、生产效率高等优点。

通过对比，柱状黄杆菌基因重组疫苗的制备方法(CN103495159A)为注射型口服疫苗，需要通过对鱼体进逐尾注射，操作较为麻烦，工作量大，而本发明的为口服疫苗，通过投喂即可进行免疫，大大减少了工作量，提高了工作效率，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用，该疫苗是一种口服疫苗，通过口服免疫的方式接种，比注射免疫和浸泡免疫疫苗使用方便，更节省劳动力，并具有不受鱼体大小限制的优点。