[发明专利]一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗、使用方法和应用

权利要求书

1.一种柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，其特征在于：制备步骤如下：

⑴分析柱状黄杆菌的保护性抗原基因lip的成熟肽段序列，按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性人工合成lip基因成熟肽段序列，在序列两端分别加入Pst I和SphI酶切位点，并通过在N端加入2个碱基确保序列不移码，在C段去掉了终止密码子TAA，合成后的lip基因序列为SEQ NO.1，共计760bp；

⑵将步骤⑴中人工合成后的lip基因序列用Pst I和SphI限制性内切酶双酶切后，与用相同限制性内切酶双酶切的载体pBE2R进行连接，构建穿梭质粒pBE2R-lip；

⑶将步骤⑵中构建的穿梭质粒pBE2R-lip转入枯草芽孢杆菌WB₈₀₀菌株，筛选得到WB₈₀₀(pBE2R-lip)菌株；

⑷将步骤⑶中筛选得到的WB₈₀₀(pBE2R-lip)菌株按体积以1:100的接种量接种于含50μg/mL卡纳霉素的LB培养基中，37℃、200rpm/min培养48h后，离心收集细菌；

⑸将步骤⑷中收集到的细菌以3.0×10⁸CFU/饲料的浓度均匀喷洒至饲料中，阴干，制备成口服疫苗，即得柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗。

2.根据权利要求1所述的柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗，其特征在于：具体制备步骤如下：

⑴从Genbank下载柱状黄杆菌lip基因序列，利用在线软件对其信号肽进行分析，获得lip基因的成熟肽段序列；根据枯草芽孢杆菌密码子的偏好性进行柱状黄杆菌lip基因成熟肽段的合成，在两端分别加入Pst I和SphI酶切位点，并通过在前端加入2个碱基确保序列不移码，去掉了终止密码子TAA，合成后序列如SEQ NO.1所示，共计760bp；

⑵将人工合成的lip基因片段进行双酶切

每20μL的酶切体系如下：

酶切三个小时后，65℃变性10min，电泳切胶回收；

⑶将双酶切后的表达片段和用同样的内切酶同步酶切的pBE2R载体连接，每10μL的连接体系如下：

16℃连接过夜；

⑷连接产物转化TOP10感受态细胞，PCR筛选重组克隆，挑选阳性克隆，测序检查基因序列的正确性；

⑸将阳性克隆株按体积以1:100的接种量接种于含50μg/mL卡纳霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇床振荡培养至OD₆₀₀为0.8～1.0，收集细菌，使用细菌质粒提取试剂盒提质粒pBE2R-lip；

⑹将枯草芽孢杆菌WB₈₀₀菌株在含1μg/mL红霉素的LB平板上划线，37℃培养箱内培养过夜；次日挑取单菌落于含1μg/mL红霉素的LB培养液中，在37℃摇床200rpm振荡培养OD₆₀₀为0.8～1.0，添加质量终浓度为1％的木糖，继续培养2h，制备成枯草芽孢杆菌WB₈₀₀菌株的感受态细胞；

⑺将质粒pBE2R-lip转入枯草芽孢杆菌WB₈₀₀感受态细胞，PCR筛选重组克隆，挑选阳性克隆，构建了枯草芽孢杆菌WB₈₀₀(pBE2R-lip)菌株；

⑻将枯草芽孢杆菌WB₈₀₀(pBE2R-lip)菌株活化后，按体积以1:100的接种量的比例接种于含50μg/mL卡纳霉素的LB培养基，37℃、200rpm培养48h后，计算细菌的浓度，离心收集细菌；

⑼将收集的枯草芽孢杆菌WB₈₀₀(pBE2R-lip)用PBS调整浓度为3×10⁹CFU/mL；按质量比将1份菌液均匀喷洒在10份饲料表面，使饲料中枯草芽孢杆菌WB800(pBE2R-lip)的含量为3×10⁸CFU/克；

⑽将喷洒了菌液的饲料阴干后，即为口服疫苗。

3.如权利要求1或2所述的柱状黄杆菌转基因工程口服疫苗在预防鱼柱状黄杆菌感染方面中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述鱼为草鱼。