[发明专利]应用TLC-CMS-IR检测米糠神经酰胺类化合物的方法

权利要求书

1.一种应用TLC-CMS-IR检测米糠神经酰胺类化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、米糠中神经酰胺样品的粗提取

粉碎：将米糠放于通风处阴干，粉碎后，过80目筛子进行筛分，备用；

浸提：配置70%的乙醇溶液，将米糠粉末放入容器中，按料液比1:10加入乙醇溶液，然后放入恒温振荡器中振荡，调节温度40℃，振荡12h；

超声波微波组合萃取仪辅助处理：用超声波微波萃取仪辅助分三个阶段进行提取，每阶段5min，共15min；具体参数为在恒定超声波的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，超声波功率为800W、900W、1000W，微波功率为250W、300W、350W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速900r/min；

离心：将提取液放在4000r/min下离心10min，3次，合并上清液，获取沉淀物和上清液；粗滤后用微膜进行过滤，过滤上清液，将沉淀物与滤渣合并；

浓缩蒸发：取上清液倒入旋转蒸发仪的圆底烧瓶中，并且打开冷凝管，设置温度为79℃，然后进行旋转蒸发，等到冷凝时没有液体蒸发出来，回收乙醇；

定容：蒸发后的物质用甲醇将其定容至25mL；

（2）、神经酰胺标准品的制备

将神经酰胺标准品放入容量瓶中，加入甲醇，在超声条件下溶解，得到1mg/mL神经酰胺标准品，将其置于2~4℃的冰箱中保存，备用；

（3）、薄层色谱技术分离纯化（TLC）

活化：用10×10cm的硅胶GH254层析板，放置在电热鼓风干燥箱中，设置温度为105℃，活化30min后备用；

点样：用微量进样器吸取25μL的样品溶液，将点样参数放在自动点样机上，其中点距10mm、点宽8mm、点数3、点样量10μL、点样速度2s/μL，在硅胶板上点样并分别取25μL神经酰胺对照品溶液，并点样三个作为对照；

展开：在层析缸中配制体积比为氯仿:甲醇:乙酸=19:0.8:0.1混合溶液，静置作为展开剂，倒入展开缸中，让其在展开缸中氤氲20~30min直至饱和，将点样完成的硅胶G板放入展开剂液面高10~15mm的平卧式展开缸内，待到展开剂前沿距离硅胶板顶端1cm处时，取出，晾干；

显色：用制备的0.1%茜素乙醇溶液喷于干燥的层析板上进行显色，并观察结果；

薄层色谱成像系统记录：将显色后的色谱板置于薄层色谱成像系统中，并在365nm紫外光下拍摄色谱图并拍照；

薄层色谱扫描仪测定含量：通过全能的薄层色谱扫描仪扫描拍摄的薄层板，并通过轨迹跟踪确定点位置参数；用手动调节位置功能确定背景及各个神经酰胺斑点的横、纵坐标，用光谱扫描确定神经酰胺的测定波长与参与波长，通过反射扫描方法确定目标点的吸收峰面积的积分值，并且通过峰面积和点量之间的线性关系确定目标点的物质含量；

紫外光谱测定：将样品用95%乙醇溶解并稀释，使用蒸馏水代替样品作为空白，将含有空白和样品的石英比色皿放入紫外扫描仪的样品槽中，并且在200~700nm的最大吸收波长下扫描样品并记录；

（4）、质谱仪检测

标准品的质谱检测：用色谱甲醇和超纯水用作流动相，打开仪器和软件使其处于工作状态，用微量进样器吸取25μL的神经酰胺标准品溶液插入到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打到Inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存；

待测液的质谱检测：流动相与测标标准品的流动相相同，使仪器和软件处于工作状态，用微量进样器吸取25μL的待测样品溶液插入到进样口处，打到Load档开始进样，进完样后打回到Inject档；点开谱图界面对谱图进行分析并保存；

（5）、红外检测

标准品的检测：打开仪器并选择相应的工作界面，用擦镜纸擦拭点样中心处，测试背景，然后用毛细管吸取标准品于点样中心处，测试样品并对谱图界面出现的谱图进行处理和分析；

待测品的检测：将第二套薄层板上画出的神经酰胺斑点置于烧杯中，加入10mL色谱甲醇，然后再将其过滤得到的滤液进行红外检测，检测步骤与标准品的检测步骤一致。