[发明专利]一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法

说明书

本发明公开了一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程技术领域。通过同源重组的方法敲除基因REV1，构建敲除菌株rev1Δ，使得酵母菌株抗氧化胁迫能力降低，具体表现为胁迫条件下敲除菌株生物量降低9％，存活率降低34.8％，基因突变频率降低63.8％，丙酮酸产量降低30.8％。利用pY26质粒过表达基因REV1，构建过表达菌株rev1Δ/REV1，使得菌株抗氧化胁迫能力增强，具体表现为生物量提高8.3％，存活率提高11.5％，基因突变频率提高186.2％，丙酮酸产量提高57.7％。上述结果表明Rev1可以提高酵母菌株在氧胁迫条件下的生存能力和发酵性能。

技术领域

本发明涉及一种利用Y家族聚合酶Rev1调节酿酒酵母氧胁迫的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

微生物在生长和代谢过程中容易受到各种外源和内源环境的攻击，外源环境主要包括电离辐射、紫外辐射以及各种化学试剂，内源环境主要包括细胞在代谢过程中产生的一些次级代谢产物。大部分这些因素都会造成细胞内活性氧的堆积，对胞内的DNA造成氧化损伤，阻碍细胞的生长和代谢。在工业应用中，酿酒酵母不仅可以用来生产酒精，还可以用来生产有机酸、蛋白质等。在生命科学领域，酿酒酵母和人类高度同源，通过对酿酒酵母基因进行分析，能够提高人类疾病的诊断和治疗水平。

提高菌株的氧胁迫抗性可以提高菌株对恶劣环境以及有毒产品的耐受能力，对微生物发酵生产化学品有一定的前景。降低菌株的氧胁迫抗性可以降低菌株的环境耐受能力，可以应用于菌株的诱变育种，耐受能力低的菌株在胁迫环境下可以产生更多的突变，有助于扩大突变库，筛选目的菌株。目前国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程、适应性进化等策略提高菌株的氧胁迫抗性。对酿酒酵母进行耐氧机制的研究可从根本上解决这一问题。

Y家族DNA聚合酶是一类特殊的DNA聚合酶，能够以损伤的DNA为模板，在损伤位点对面插入正确或错误的核苷酸，从而跨越损伤位点，使细胞免于因复制停滞造成的细胞周期延迟和细胞死亡。在酿酒酵母中，Y家族DNA聚合酶包括Polη和Rev1，分别由RAD30和REV1基因编码。其中Polη主要在紫外线诱导的DNA损伤中起作用，也能够修复氧胁迫造成的DNA损伤。Rev1是一种脱氧胞苷转移酶，不仅具有核苷酸转移酶的催化活性，也具有非催化活性，其非催化活性在于能够与其他Y家族DNA聚合酶或者辅助蛋白相互作用，参与各种类型的跨损伤合成。

丙酮酸在能量代谢过程中具有重要的作用，同时也是合成多种工业化合物的前体物质，广泛应用于化学、制药、食品、农业等领域。目前丙酮酸的合成主要为微生物发酵法，酵母是重要的发酵宿主。然而在发酵过程中丙酮酸浓度过高对酵母有毒害作用，过高的酸浓度会导致胞内ROS水平升高，造成DNA和蛋白质氧化损伤。

综上所述，提供一种调节酿酒酵母氧胁迫且能够调节丙酮酸产量的方法，对于其工业应用有重要价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种酿酒酵母工程菌，是在不表达REV1基因，或过表达REV1基因；所述不表达REV1基因是指敲除或沉默REV1基因。

在本发明的一种实施方式中，所述REV1基因的核苷酸序列如NCBI上的gene ID:854527的核苷酸序列所示。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiaeBY4741(https://www.yeastgenome.org/strain/S000203456)，基因型为MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0。

在本发明的一种实施方式中，所述不表达REV1基因包括：将标记基因同基因REV1的左同源臂、右同源臂连接起来，构建敲除框，将敲除框导入酿酒酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因REV1替换成标记基因。