[发明专利]一种原核工程菌株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种原核工程菌株及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该原核工程菌株表达的蛋白为甘油二酯乙酰化转移酶，甘油二酯乙酰化转移酶的氨基酸序列表中SEQ ID NO:1所示。该制备方法包括：将DAcT基因与载体连接，得到连接产物；将连接产物转入感受态细胞中，得到转化产物；将转化产物于37℃下200rpm摇床培养0.6～1h，得到复苏液；将复苏液离心，得到浓缩液；将浓缩液涂布在含卡那霉素抗性的固体培养基上，于37℃下培养8～12h。该原核工程菌株在25℃下培养24‑48h后，在细胞内合成高纯度的乙酰化甘油三酯，可以通过该原核工程菌株实现高纯度乙酰化甘油三酯的规模化生产。该制备方法能够获得原核工程菌株，为乙酰化甘油三酯进行规模化生产提供基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种原核工程菌株及其制备方法和应用。

背景技术

乙酰化甘油三酯是一种在sn-3端包含乙酰基团的特殊的甘油三酯。相较于常规的长链甘油三酯，乙酰化甘油三酯具有粘度低、在低温环境下活性好的优点，因此乙酰化甘油三酯能够直接应用于柴油当中作为生物燃料。另外，源于sn-3端的酰基，乙酰化甘油三酯能够作为1，2-二乙酸甘油三酯的半合成产物，这一类脂类能够应用于食物的乳化剂，润滑油，PVC的增塑剂和其他塑料制品。

美国的Tam等人尝试用卫矛属(Euonymus)植物来源的乙酰化甘油三酯合成酶基因对亚麻荠(Camelina sativa)、大豆、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行基因工程改造，得到重组酿酒酵母，利用该工程株合成乙酰化甘油三酯。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

重组酿酒酵母菌除了合成乙酰化甘油三酯外，同时还会合成常规的甘油三酯，且合成的乙酰化甘油三酯仅为每克重组酿酒酵母菌干重的0.24％左右，占总甘油三酯重量的31％。若通过敲除重组酿酒酵母中合成常规的甘油三酯的编码基因后，虽能够使重组酿酒酵母菌只合成乙酰化甘油三酯，但同时生成的乙酰化甘油三酯仅为每克重组酿酒酵母菌干重的0.15％左右，且细胞生物量大幅减少。这极大的限制对乙酰化甘油三酯的提取与纯化，不利于乙酰化甘油三酯的大规模生产。

发明内容

本发明实施例提供了一种原核工程菌株及其制备方法和应用，该原核工程菌株能够单一的合成高纯度的乙酰化甘油三酯。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种原核工程菌株，所述原核工程菌株表达的蛋白为甘油二酯乙酰化转移酶，所述甘油二酯乙酰化转移酶的氨基酸序列表中SEQ ID NO:1所示。

另一方面，本发明实施例提供一种上述原核工程菌株的制备方法，所述制备方法包括：

将EfDAcT基因与载体连接，得到连接产物；

将所述连接产物转入感受态细胞中，得到转化产物；

将所述转化产物于37℃下发酵培养0.6～1h，得到复苏液；

将所述复苏液离心，得到浓缩液；

将所述浓缩液涂布在含壮观霉素抗性的固体培养基上，于37℃下摇床培养8～12h，得到所述原核工程菌株。

具体地，采用热击法将所述连接产物转入所述感受态细胞中。

具体地，所述热击法包括：将所述连接产物和所述感受态细胞混合后，置于冰上30～40min，得到混合液，将所述混合液置于42℃水浴锅中热击45s后，在冰上冷却2min，得到所述转化产物。

具体地，所述载体为pCDFDuet-1或pRSFDuet-1。

具体地，所述感受态细胞为普通的大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞。