[发明专利]一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用

说明书

本发明提供一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。本发明是将野生型传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸，获得IBV突变型病毒株。该突变株的获得有助于研究IBV HiBiT‑S2融合蛋白的结构、病毒的增殖能力、形成空斑的大小，并可判断病毒的复制能力和致病力是否发生改变，并且为定量IBV提供了新方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。

背景技术

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的γ冠状病毒亚属，是该亚群的代表病毒，也是最早分离获得的冠状病毒。IBV可引起鸡急性、高度接触性传染病，是影响全球禽业的主要病原之一，自1931年首次分离以来，世界各地发现了数量惊人的IBV变异体。IBV病原变异不断出现，且缺乏有效、广谱保护的IBV疫苗，因此，对IBV这一经济上重要的病原生物学进行研究是十分关键的。以IBV作为冠状病毒的原型的几十年的研究揭示了分子细胞生物学和冠状病毒发病机制中的一些最基本的概念，但是冠状病毒成功建立反向遗传系统的却只有少数几种。

IBV是单股正链RNA病毒，含有一个长27.6KB的RNA基因组，排列顺序为5’-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3’，S、M、N和E是其结构蛋白，参与病毒粒子的组成。S蛋白是冠状病毒分子量最大的结构蛋白，属于I型跨膜蛋白，具有巨大的N端胞外域，1个跨膜域和极短的C-端域。在IBV中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成大小大致相同的两个功能亚基，N端的S1域和C端S2域。

目前常规使用的IBV定量方法主要是半数组织培养感染剂量实验(TCID₅₀)和噬斑实验，这两种方法都是通过连续稀释病毒液后取一定体积的病毒稀释液感染细胞，时隔三四天后观察细胞病变情况计算病毒的滴度。操作复杂，误差大，其准确性有待考察，当需要大批定量IBV病毒样品时，此类方法极其耗时耗力，因此急需一种更高通量并且更快更精确的IBV病毒定量方法。

HiBiT是一种11-氨基酸肽标签，与目的蛋白质融合表达后可与底物腔肠素和LgBiT紧密结合(KD＝0.7nM)，促进细胞裂解物复合物的形成，产生明亮的发光酶。继而可确定细胞中目的蛋白质的量，发光量与细胞裂解物目的蛋白质的浓度呈正线性相关，发光型发光信号稳定数小时。利用此特性，将HiBiT标签插入某一IBV结构蛋白，获得重组病毒，将能快速、准确的定量IBV。但IBV病毒基因组十分紧凑，对外源序列的插入敏感，在庞大的基因组序列内找到稳定遗传并成功表达外源基因的位点较为困难。

发明内容

本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。此重组病毒传代稳定，能够精确定量IBV病毒。

本发明的另一目的在于提供上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的应用。

本发明的目的通过下列技术方案实现：一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，是将野生型传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸得到。

所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示。

编码所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白核苷酸序列如SEQ NO.2所示。