[发明专利]一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用

权利要求书

1.一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：是将野生型传染性支气管炎病毒的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸得到；

所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：编码所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：是采用反向遗传学技术，获得IBV全长感染性克隆，再以其为模板，在IBV S蛋白第539位氨基酸插入HiBiT，体外转录电转染细胞，获得IBV突变型病毒株。

4.根据权利要求3所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)将横跨整个IBV基因组的片段依次为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E，纯化，克隆入载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D和重组载体E；在构建过程中，将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端，并且在A片段中将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；

(2)扩增含有HiBiT片段的野生型IBV的S蛋白部分序列，无缝克隆到野生型IBV的S蛋白所在的E片段，获得野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段质粒；

(3)将片段A、B、C、D和野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段连接，纯化，体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKT0-N质粒为模板，体外转录，得到N转录本；

(4)将步骤(3)得到的全长转录本和N转录本电转至Vero细胞，培养，出现典型细胞病变，即得到S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。

5.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D和片段E是利用RT-PCR技术从IBV感染的非洲绿猴肾细胞中提取总RNA，再扩增得到；

步骤(1)中所述的将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端是通过扩增所用的引物引入；

步骤(1)中所述的将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游是通过扩增所用的引物引入。

6.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的片段A引入的限制性位点为BsmBI；

步骤(1)中所述的片段B引入的限制性位点为BsaI；

步骤(1)中所述的片段C引入的限制性位点为BsaI；

步骤(1)中所述的片段D引入的限制性位点为BsaI；

步骤(1)中所述的片段E引入的限制性位点为BsaI；

步骤(1)中所述的片段A适用的载体为pKT0；

步骤(1)中所述的片段B适用的载体为pGEM-T Easy；

步骤(1)中所述的片段C适用的载体为pCR-TOPO-XL；

步骤(1)中所述的片段D适用的载体为pGEM-T Easy；

步骤(1)中所述的片段E适用的载体为pGEM-T Easy。