[发明专利]维生素B

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物、探针、试剂盒及方法。本发明设计了一种维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445，引物的核苷酸序列为：正向引物为5’‑CGA GCT TTT GCG CGT ATA‑3’，其反向引物为5’‑GCC ATT CCA ATA CAAAAC CAC ATA‑3’，以及探针、试剂盒和检测方法。本发明能精确检测维生素B₂产品中枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM‑10445生产菌株残留DNA，开发了一种检测所涉及的引物、探针、试剂盒及检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测方法及所用引物、探针、试剂盒。

背景技术

维生素B₂是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用。维生素B₂的生产工艺主要有4种：植物体提取法、化学合成法、微生物发酵法和半微生物发酵合成法，其中微生物发酵法由于一系列的优点目前已成为维生素B₂工业化生产的主要方法。微生物发酵法生产维生素B₂主要用的生产菌种有阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)等。由于天然菌合成维生素B₂的发酵周期长(6-8天)、自身存在反馈抑制导致维生素B₂的生产效率低，但随着分子生物学研究的深入以及基因操作技术的日益成熟，目前已经成功构建出用于维生素B₂发酵的基因工程菌，主要是以枯草芽孢杆菌(B.subtillis)作为受体菌进行基因改造以用于发酵合成高产维生素B₂。基因工程菌发酵合成维生素B₂的三个明显优势在于：首先，基因工程菌生产速率快，而且维生素B₂的合成是生长相关型的，可以缩短发酵周期，大大提高生产效率；其次，基因工程改造修饰相对于诱变选育，具有更大的潜力和操作空间；最后，基因工程菌发酵过程中使用可再生资源，生产过程污染少，产品纯度高，安全性好，使得其在维生素B₂的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。但是基因工程菌在构建过程中，常常需要引入外源抗性基因作为筛选的标记，这些抗生素抗性基因可能会造成新型的环境污染物。一方面，在自然界中这些抗性基因片段存在转移到其它细菌中的可能性，使得抗性基因在自然界的细菌中扩散，从而导致目前人类所使用的抗生素失效，威胁到人类和动物的健康，另一方面，终产品中生产菌株的DNA残留可能会引起动物和人的过敏反应，同时抗性基因可能会发生转移，随着被污染生物的繁殖而得到增殖再扩散造成基因污染。因此要严格控制微生物发酵产品的质量，在最终产品中，既不能检测到生产菌株，也不能检测出完整的抗性基因和生产菌株的DNA，防止基因污染，保护产品的安全性和使用安全性。所以，对维生素B₂产品中基因工程菌残留DNA进行限量检测，确定产品质量确保使用安全是非常有必要的，具有深远意义。

实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术是在PCR反应体系中加入荧光标记基团，利用收集荧光信号的累积来实时监控整个PCR扩增，最后得到扩增荧光信号阈值循环数(Ct)，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其中，Tapman探针因其具有极高的特异性和准确性、良好的重复性，使得其在高特异性qPCR中应用广泛。实时荧光定量PCR技术将核酸的扩增和杂交技术、光谱分析技术和实时检测技术融合在一起，具有灵敏度高、特异性强、高通量和定量准确等特点，使得其应用非常广泛，不仅可以定性检测医学领域的病原DNA，还可定量检测病原量，且食品药品行业可以检测致病菌、DNA残留等，在植物学领域还可以检测植物病原菌。

发明内容