[发明专利]维生素B

权利要求书

1.一种维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测引物，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis KCCM-10445，其特征在于引物的核苷酸序列为：正向引物为5’-CGA GCT TTTGCG CGT ATA-3’，其反向引物为5’-GCC ATT CCA ATA CAA AAC CAC ATA-3’。

2.一种维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测探针，其特征在于：探针序列为FAM-CGGATC TAA CGC ATG CTC CGC A-BBQ。

3.一种维生素B₂中生产菌株残留DNA的qPCR检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针和qPCR扩增组件。

4.权利要求3所述的试剂盒在检测维生素B₂中生产菌株残留DNA的应用。

5.权利要求3所述的试剂盒检测维生素B₂中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：首先提取游离DNA，进行连续梯度稀释，再使用引物、探针和荧光定量PCR扩增组件组成的试剂盒进行qPCR分析，根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值得到了qPCR分析的标准曲线及相关系数R²和扩增效率E进行判断。

6.根据权利要求5所述的试剂盒检测维生素B₂中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：所述提取游离DNA为从维生素B₂样品中提取生产菌株DNA，包括以下步骤：

步骤1：称取1g核黄素样品，置于50mL离心管中；

步骤2：加入2.5mL裂解缓冲液A和25μL RNA酶，加入25μL溶菌酶，盖上管并涡旋振荡，在37℃水浴孵育15min；

步骤3：加入1.25mL裂解缓冲液B，涡旋振荡10-15s，然后将试管在22–25℃的室温下孵育10min；

步骤4：加入3.75mL沉淀液，剧烈涡流；

步骤5：以3000-5000×g的速度旋转10min；

步骤6：将上层清液转移到新的50mL试管中，加入定量的B.subtilis KCCM-10445基因组DNA，混合均匀；

步骤7：取一瓶磁珠混合液颠倒15-30s使磁珠彻底重悬；

步骤8：向上清液添入100μL重悬好的磁珠悬浮液，然后涡流振荡；

步骤9：加入0.8体积的异丙醇后将管子颠倒10-15次混匀，然后室温下静置5min；

步骤10：将管子放磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；

步骤11：从支架上取下管子，加入1.25mL裂解缓冲液B，将管子颠倒2-3次混匀，然后将管子放回磁力架上，待上清液变清澈后，弃上清液；

步骤12：加入5mL洗涤液，将试管放在支架上1min，弃上清液，再重复两次，共洗3次；使用移液器除去并丢弃液体；

步骤13：干燥磁珠，在室温下干燥15-30min或在65℃下干燥10min；

步骤14：加入100-400μL无核酸酶水，涡旋，并在65℃下放置5min，把管子放在磁性支架上，待上清液变清澈后，将上清液转移到另一个离心管中。

7.根据权利要求5所述的试剂盒检测维生素B₂中生产菌株残留DNA的方法，其特征在于：qPCR在25μL的PCR反应体系中进行；所述进行连续梯度稀释为将B.subtilis KCCM-10445全基因组DNA梯度稀释为10ng/g，1ng/g，10^-1ng/g，10^-2ng/g，10^-3ng/g，10^-4ng/g，10^-5ng/g，10^-6ng/g八个不同浓度，作为后续qPCR扩增的模板；PCR反应体系中含有12.5μL 2x Taq TM探针混合液、每个引物0.4mM、0.1mM探针和2μL模板DNA，qPCR扩增热循环条件为先在95℃变性10min，然后再经过45个94℃变性40s、60℃复性延伸的循环扩增出目的片段。